论文部分内容阅读
背景与目的：
CD4+效应性T细胞按其细胞因子的产生模式可分为Th1和Th2两种类型。Th1和Th2细胞在机体免疫中起不同的作用。Th1型细胞主要介导针对细胞内病原体如细菌、病毒感染引起的细胞免疫,Th2型细胞主要介导体液免疫和过敏反应等。T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子(T-cell immunoglobulin andmucin-domain-containing molecule,Tim)是新近发现在T细胞表面的跨膜蛋白家族,它对辅助性T细胞(Th1和Th2)的分化和调控起着重要作用。其中Tim-3是Tim家族中的一个重要的成员,它是终末分化的Th1细胞表面标志,不表达于初始T细胞、B细胞。Tim-3与Tim-3配体(galectin-9)结合从而下调Th1型免疫应答,进而推测Tim-3可以通过调节Th1细胞反应,从而调节机体的免疫功能。但近年研究表明Tim-3除了在Th1细胞上表达外,还在Th17细胞、Treg、单核巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞、肥大细胞和某些肿瘤细胞上表达。Tim-3在这些细胞中表达的作用各有差异,提示Tim-3除了调节Th免疫反应外可能还具有多种生物学作用,但是其确切作用尚不清楚。为此,本文从人外周血单个核细胞(PBMC)中用RT-PCR的方法扩增出人Tim-3 cDNA,构建出人Tim-3的真核表达载体。并观察了其在肝癌细胞和巨噬细胞中的表达,为后续研究进一步研究其生物学功能并最终应用于临床基因治疗奠定基础。
方法：
①获得健康人外周血的单个核细胞并克隆人Tim-3基因:取健康人外周血3ml,用淋巴细胞分离液分离出PBMC。获得人Tim-3基因:提取PBMC的总RNA,再逆转成cDNA,PCR法获取带酶切位点的人Tim-3基因。
②人Tim-3基因的亚克隆:带有A尾的PCR产物连接到pGEM-T载体上,连接产物转化进感受态大肠杆菌DH5a,菌液涂布在含Amp、X-gal和IPTG的LB固体培养基上,37℃培养16～24h出现蓝白斑菌落,挑取白斑单克隆菌落放入含Amp的LB液体培养基中摇菌,提取质粒,PCR、酶切和测序鉴定是否为人Tim-3基因。
③构建人Tim-3基因真核表达质粒:双酶切后的pEGFP-N1真核表达载体和从pGEMT-T-Tim-3重组质粒中双酶切下的Tim-3基因连接过夜,转化进感受态大肠杆菌DH5a,菌液涂布在含卡那霉素的LB固体培养基上,培养16～24h出现单克隆菌,挑取单克隆菌,在含卡那霉素的LB液体培养基中扩增大肠杆菌,提取质粒,最后PCR、酶切和测序鉴定是否为人Tim-3基因。
④肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937培养:加有10％FBS的高糖DMEM培养细胞,隔天换液,细胞长满培养瓶90％时传代培养。
⑤Tim-3基因真核表达质粒的转染:pEGFP-N1-Tim-3真核表达质粒溶液和脂质体溶液孵育后转染至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。荧光显微镜观察质粒转染细胞48h后绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。
结果：
①利用RT-PCR技术从正常健康成年人外周血单个核细胞中扩增出了Tim-3基因,琼脂糖凝胶电泳证实核酸大小与预计一致,并成功构建了Tim-3基因的重组质粒pGEM-T-Tim-3。测序结果证实Tim-3基因完整无误的正向单倍插入到pGEM-T载体中。
②成功构建了pEGFP-N1-Tim-3重组质粒,测序分析显示Tim-3序列为完整无误正向、单倍的插入,插入片段与PubMed基因文库(GenBank accessNM032782.3)中的Tim-3基因序列的相似性为100％。
③重组质粒pEGFP-N1-Tim-3成功转染进肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中,RT-PCR结果显示融合基因能有效转录,荧光显微镜下成功观察到绿色荧光蛋白的表达,且绿色荧光蛋白定位于肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937的细胞膜上,进一步证实了Tim-3蛋白为细胞膜蛋白。
结论：
①本研究用RT-PCR方法,以健康人外周血单个核细胞为模板,扩增出Tim-3基因,亚克隆至pGEM-T载体,成功构建pGEM-T-Tim-3重组质粒。
②将pGEM-T-Tim-3重组质粒酶切下带有限制性酶切位点的Tim-3基因和双酶切后的pEGFP-N1表达载体连接,成功构建出pEGFP-N1-Tim-3真核表达质粒。
③RT-PCR结果显示融合基因能有效转录,荧光显微镜下清晰显示出目的蛋白定位于肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937的细胞膜上,符合Tim-3蛋白是细胞膜跨膜蛋白的特点,表明真核表达质粒能够在肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中表达,且定位准确。
④成功地构建了pEGFP-N1-Tim-3真核表达质粒,并且在多种真核细胞中表达,说明其可用性。这为后续研究Tim-3在不同细胞中的作用,及以Tim-3为靶点治疗疾病奠定了基础。