棉花中两个新的PPR基因的克隆及功能分析

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PPR(Pentatricopeptide repeat)蛋白是近年来在植物中新发现的一类蛋白质超家族,广泛存在于陆生植物中,在植物生长发育过程中具有重要作用。PPR蛋白大多定位在质体或线粒体中,参与基因表达调控的各项进程,包括转录、翻译、RNA编辑及RNA剪接等。研究表明植物中PPR基因缺失后会导致植株生长迟缓、叶片黄化、种子败育、花期延迟等一系列不良表型。本研究以陆地棉徐州142为实验材料,利用棉花EST库设计引物,通过PCR技术克隆得到GhPPR9、GhPPR11基因的cDNA及DNA全长序列;应用生物信息学方法分析其结构特征;利用实时荧光定量PCR研究基因在不同组织部位及不同逆境环境下的表达模式;用叶肉细胞原生质体研究两个PPR蛋白在细胞中的定位,在此基础上,构建VIGS载体,转化棉花,分别干涉GhPPR9和GhPPR11基因的表达,检测转基因棉花的各项生理生化指标,以期深入研究这两个基因在棉花中的功能。取得的主要研究结果如下:1、GhPPR9的cDNA全长3072bp,编码1023个氨基酸,没有内含子,分子量114.22kD,等电点7.17。GhPPR9属于PPR基因家族的P亚族,有25个PPR基序;与可可(XP007038120.1),蓖麻(XP 002511099.1)等有较高的同源性。GhPPR11的cDNA全长1914bp,编码637个氨基酸,没有内含子,分子量71.53kD,等电点7.79。GhPPR11属于PPR基因家族的PLS亚族,有13个PPR基序;GhPPR11与可可中的PPR蛋白(XP007052071.1)相似度最高,与克莱门柚(XP006445271.1)也有较高的同源性。2.GhPPR9亚细胞定位结果预测该基因定位在线粒体上;GhPPR9在根、茎、叶、花及纤维的不同发育时期均有表达,在花和开花后5天的纤维中表达较高,且不受胁迫诱导,可能与花和纤维发育有关。3.GhPPR11蛋白定位于细胞核与细胞质中。GhPPR11在不同组织中表达量都很低;对生长1周的棉花幼苗分别进行ABA,NaCl,干旱和高温处理,GhPPR11均有响应,并且在6小时、9小时对四种胁迫处理的响应达到峰值,表明GhPPR11的表达可能与棉花耐逆性有关。4、利用病毒介导基因沉默(VIGS)的方法,构建VIGS载体,对棉花中的GhPPR9及GhPPR11分别进行了基因干涉,检测了它们的表型特征,与WT和对照组相比,在植株高度上表型变化不大,棉桃数量相对较少,GhPPR9的叶绿素含量低。
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