大部分数鱼类是变温动物,寒冷压力对于鱼类的生长以及生殖等重要过程都具有重大的影响,鱼类冷适应机制一直以来都是研究的热点。环境温度变化具有即时性的特点,传统遗传学无法很好地解释短时间内产生的冷适应性状,这就需要通过表观遗传学进行分析研究。鱼类作为真核生物,其细胞核内的染色质高级结构具有复杂且高度动态化的特点。根据环境压力变化,在较短的时间内调控基因的表达,产生有利的性状,能够帮助生物快速适应环境,获得生存优势。染色质开放域以及染色质环是染色质结构的主要组成部分。致密压缩的染色质通常较不活跃,而开放性的染色质通常较活跃;染色质还可以通过形成染色质环的方式,实现中远距离的调控,例如相隔较远的增强子与启动子互作。传统的染色质相互作用研究手段有着通量低以及分辨率较低的缺点。测序技术的发展,带来了新的染色质构象捕获技术,其中,Hi-C技术因其能够一次性检全部位点互作的优点而脱颖而出,然而Hi-C依赖邻近连接来寻找目的片段,而邻近连接的过程中存在随机连接,因而容易产生噪声,此外,该技术还要求极高的测序深度。为解决Hi-C技术中的弊端,NIH的研究团队开发了Trac-looping(transposase-mediated analysis of chromatin looping)技术,并已于2018年8月在Nature Methods杂志发表。该技术利用转座酶Tn5的“剪切-粘贴”机制,使用转座酶复合物为染色质开放区的DNA加上带有生物素标记的转座子序列(测序引物的互补序列),并且能够使空间位置靠近的染色质开放区的DNA片段发生随机重组,生物素纯化筛选阳性片段后,在极低浓度下进行分子内环化连接,经过滚环扩增后,根据转座子序列设计引物,进行建库PCR,通过高通量测序分析染色质的开放域以及互作。Trac-looping技术在使用生物素纯化筛选阳性片段后,再进行邻近连接,从源头上降低了随机连接出现的可能性,保证了所筛选出的邻近连接片段的可信度,降低噪声的同时,减少了测序深度的需求,也提升了分辨率。在本课题中,作为Trac-looping实验的准备工作,以毒性蛋白诱导条件原核表达并纯化了高活性转座酶Tn5,并采用在标准条件下与ZF4细胞基因组DNA的梯度试验,鉴定了Tn5的活性。使用全新的Trac-looping技术探究了斑马鱼ZF4细胞基因组DNA在30天的冷适应后,其染色质高级结构所产生的变化:获得了斑马鱼ZF4细胞冷适应前后的染色质互作精确图谱;定位了染色质开放性差异位点;对染色质开放性差异基因进行注释;结合H3K4me3以及H3K27ac表观数据,对冷适应相关基因增强子-启动子的互作进行了预测。