目的乳腺叶状肿瘤（phyllodes tumours,PTs）是一种少见的纤维上皮性肿瘤,2012年WHO乳腺肿瘤病理学新分类仍保持对该肿瘤的命名和分类标准,将其分为良性、交界性和恶性。该病局部切除术后易于复发,恶性者易于发生血行转移。国内外已经开展了一些免疫组化和分子生物学等方面的研究。本课题组前期研究通过比较基因组杂交技术筛选出三类叶状肿瘤中染色体4q12位点有增益的差异,该增益的染色体区域所对应的候选基因有SCFR（干细胞因子受体原癌基因家族stem cell factor receptor oncogene homolog,KIT,c-kit,CD117）。本研究旨在探讨叶状肿瘤中c-kit间质过表达与KIT基因拷贝数变化之间的相关性,进一步探讨叶状肿瘤恶性进程的发生发展机制。据美国监测、流行病学与最终结果（SEER）数据库资料显示每年每10万女性有2.1例被诊断为恶性乳腺叶状肿瘤。与良性和交界性叶状肿瘤比较,恶性叶状肿瘤更具独特的组织结构和细胞形态,也更具高的复发率及转移率,从而导致预后不良甚至危及生命。目前对恶性叶状肿瘤的恶性分级尚未有统一标准,且国内外各类研究中缺乏专项探讨恶性叶状肿瘤生物学行为及临床病理特征的回顾性研究,为了探讨恶性叶状肿瘤恶性分级的标准及意义,以及恶性叶状肿瘤生物学行为和临床病理学特征对无病生存、无转移生存以及总生存率的影响,进行本研究。方法1、通过本课题组前期进行的乳腺叶状肿瘤染色体异常的比较基因组杂交研究得知良性与交界性、恶性叶状肿瘤在染色体4q12（增益）处有差异（P<0.05）,选定该染色体区域所对应的候选基因SCFR（干细胞因子受体原癌基因家族stem cell factor receptor oncogene homolog,KIT,c-kit,CD117）。研究中包括2005年至2014年天津医科大学肿瘤医院乳腺叶状肿瘤病例348例,此研究期间共有恶性叶状肿瘤113例,并采取随机抽样的方法抽取良性叶状肿瘤120例和交界性叶状肿瘤115例。运用免疫组化的方法分别检测c-kit在良性、交界性和恶性叶状肿瘤中上皮以及间质表达的差异。2、因间质部分为叶状肿瘤的肿瘤性成分,故按照c-kit间质表达情况将病例分为c-kit表达阳性组和c-kit表达阴性组。通过组织HE染色定位,选取肿瘤组织丰富的区域进行石蜡组织提取DNA实验,提取叶状肿瘤组织DNA,以进行基因组PCR实验。3、结合基因组PCR引物设计原则与实时定量PCR实验引物设计原则,针对KIT基因的15号外显子和18号外显子设计引物,选取在叶状肿瘤中无表达差异的ACTB（β-actin）作为内参,进行基因组PCR实验,探讨KIT基因拷贝数变化与c-kit间质表达之间的相关性。4、总结天津医科大学肿瘤医院从1987年4月至2013年12月共计188例恶性叶状肿瘤病例,所有病例经过手术切检,福尔马林固定,切片HE染色后由三位病理医生进行诊断并且分级。根据世界卫生组织对乳腺肿瘤的分类,当叶状肿瘤中同时出现间质细胞核多形性、间质过度生长从而使一个低倍视野下不能检出上皮成分仅存在间质成分、核分裂象增多（≥10/10HPF）、间质细胞过度弥漫性生长以及肿瘤浸润性边界应诊断为恶性叶状肿瘤。当叶状肿瘤中出现恶性异源性成分时,即使不同时出现以上情况也可诊断为恶性叶状肿瘤。叶状肿瘤的肿瘤性成分为间质成分,故结合叶状肿瘤的特点与软组织肉瘤分级标准对恶性叶状肿瘤进行恶性等级分级,结合肿物的间质异型性、间质过度生长情况、核分裂象数目、间质分化程度及异源性化生情况和肿物坏死情况将恶性叶状肿瘤分为低度恶性、中度恶性和高度恶性叶状肿瘤。分析患者年龄、肿瘤大小、患病侧别、近期快速增长史、疼痛、低分级病史、异源性化生成分以及复发转移死亡与恶性叶状肿瘤恶性等级之间的相关关系。运用单因素分析和多因素分析探讨与恶性叶状肿瘤局部复发和远处转移有关的临床病理学特征。运用单因素生存分析以及多因素生存分析,分析患者年龄、肿瘤大小、患病侧别、近期快速增长史、疼痛、低分级病史、异源性化生成分以及恶性等级对无病生存、无转移生存以及总生存率的影响。结果1、研究中包括乳腺叶状肿瘤病例348例,其中良性叶状肿瘤共计120例,占研究全部病例的34.4%;交界性叶状肿瘤115例,占研究全部病例的33.1%;恶性叶状肿瘤113例,占研究全部病例的32.5%。c-kit间质阳性表达者共计163例,研究病例的c-kit间质染色总体阳性率为46.8%,其中良性、交界性和恶性叶状肿瘤c-kit间质表达阳性率分别为24.2%、53.1%和64.6%。C-kit间质表达阳性率随叶状肿瘤等级升高而升高,且具有统计学意义（P<0.001）。C-kit间质表达与叶状肿瘤的等级呈正相关关系（Pearson相关系数为0.319,P<0.001）。进一步进行两两比较,良性叶状肿瘤c-kit间质阳性表达与交界性叶状肿瘤c-kit间质阳性表达具有明显差异,且具有统计学意义（P<0.001）;良性叶状肿瘤c-kit间质阳性表达与恶性叶状肿瘤c-kit间质阳性表达具有明显差异,具有统计学意义（P<0.001）;而交界性叶状肿瘤与恶性叶状肿瘤c-kit间质表达差异无统计学意义（P=0.102）。2、C-kit上皮表达阳性共计328例,总体阳性率达98.2%,其中良性、交界性与恶性叶状肿瘤c-kit上皮阳性表达率分别为100%、99.1%和95%。C-kit上皮表达阳性率随叶状肿瘤等级升高而降低,具有统计学意义（P=0.014）。C-kit上皮阳性表达与叶状肿瘤的等级呈负相关关系（Pearson相关系数为-0.149,P=0.006）。进一步进行两两比较发现良性叶状肿瘤c-kit上皮阳性表达与恶性叶状肿瘤c-kit上皮阳性表达有明显差异,具有统计学意义（P=0.013）;而良性叶状肿瘤与交界性叶状肿瘤以及交界性叶状肿瘤与恶性叶状肿瘤之间c-kit上皮表达差异无统计学意义（P=1.057,P=0.068）。3、对所有348例病例进行DNA提取,据DNA质控以及实时定量PCR实验的原则要求,共计42例叶状肿瘤进行基因组PCR实验。对42例叶状肿瘤病例按照c-kit间质表达情况进行分组,c-kit阳性表达组共计29例（占所有进行基因组PCR实验病例的69.1%）与c-kit阴性表达组共计13例（占所有进行基因组PCR实验病例的30.9%）。针对KIT基因15号外显子设计引物进行的基因组PCR实验中,共计34例样本KIT基因拷贝数增加,占所有进行基因组PCR实验病例的80.9%,其中c-kit阳性病例为27例,占所有实验c-kit间质阳性病例的93.1%;c-kit阴性病例中KIT基因拷贝数增加为7例,占所有实验c-kit间质阴性病例的53.8%,两组间具有差异且具有统计学意义（P=0.003）。相关性分析KIT基因拷贝数增加与c-kit间质过表达的关系,证明叶状肿瘤中c-kit间质阳性表达与KIT基因拷贝数增加具有相关性（Pearson相关系数为0.462,P=0.002）。4、针对KIT基因18号外显子设计引物进行的基因组PCR实验中,共计36例样本KIT基因拷贝数增加,占所有进行基因组PCR实验病例的85.7%,其中c-kit阳性病例为27例,占所有实验c-kit间质阳性病例的93.1%;c-kit阴性病例中KIT基因拷贝数增加为9例,占所有实验c-kit间质阴性病例的69.2%,两组间有差异且具有统计学意义（P=0.041）。相关性分析KIT基因拷贝数增加与c-kit间质过表达的关系,证明叶状肿瘤中c-kit间质阳性表达与KIT基因拷贝数增加具有相关性（Pearson相关系数为0.315,P=0.042）。与针对KIT基因15号外显子设计引物进行的基因组PCR实验结果一致。5、结合恶性叶状肿瘤的组织学特点以及软组织肉瘤的分级标准,制定恶性叶状肿瘤的分级标准:将间质异型性与间质细胞过度生长分为两级,评分分别为1,2;根据核分裂象多少分为三级别,分别为10-14/10 HPF、15-20/10 HPF和≥20/10 HPF,评分别为1-3;根据间质分化以及异源性化生情况分为三级,无异源性化生成分或者分化良好的异源性化生成分（例如高分化脂肪肉瘤）评分为1分,有明确诊断的异源性化生成分评分为2分,有两种及两种以上异源性化生成分以及胚胎或未分化肉瘤、滑膜肉瘤或骨肉瘤者评分为3分;根据肿瘤坏死情况评分,肿瘤无坏死成分者评分为0分,坏死成分占肿瘤小于50%者评分为1分,坏死成分占肿瘤大于等于50%者评分为2分。根据以上评分系统将各项评分加和,获得对恶性叶状肿瘤的评分,并根据评分将恶性叶状肿瘤分为三级:4-6分为低度恶性叶状肿瘤,7-9分为中度恶性叶状肿瘤,10-12分为高度恶性叶状肿瘤。188例恶性叶状肿瘤中,低度恶性叶状肿瘤为88例（46.8%）,中度恶性叶状肿瘤为77例（41%）,高度恶性叶状肿瘤为23例（12.2%）。6、恶性叶状肿瘤的恶性等级与临床病理学特征及预后的相关关系经过统计学分析得出,恶性等级与手术方式的选择有关（P<0.001）,恶性程度越高越多选择全乳切除术,而恶性程度较低的患者则更多选择切缘阴性的局部广泛切除术;恶性程度不仅与治疗相关,还与远处转移（P<0.001）和死亡（P<0.001）的不良预后有密切关系;分析中发现恶性等级越高的恶性叶状肿瘤患者具有肿物更大（肿物最大径≥5cm）、年轻（年龄<35岁）的特征,以及更多的患者具有疼痛和近期快速增长的临床症状,但无统计学意义。7、对于与肿瘤局部复发有关的临床病理学特征进行分析,随访期间共计37例恶性叶状肿瘤患者发生局部复发,总体复发率为19.7%,其中16例为低度恶性叶状肿瘤,占研究中所有低度恶性叶状肿瘤的18.2%;20例为中度恶性叶状肿瘤,占研究中所有中度恶性叶状肿瘤的26%;1例为高度恶性叶状肿瘤,占研究中所有高度恶性叶状肿瘤的4.3%。经单因素分析发现年轻（P=0.040）、肿物具有异源性化生成分（P=0.013）以及选择乳房全切术（P=0.031）的患者更易发生复发,为排除混杂因素的影响进一步进行多因素分析发现年轻（P=0.012）以及肿物具有异源性化生成分（P=0.027）对恶性叶状肿瘤的复发有影响,而术式的选择并非恶性叶状肿瘤复发的影响因素（P=0.065）。8、对于与肿瘤远处转移有关的临床病理特征进行分析,随访期间共计10例恶性叶状肿瘤患者发生远处转移,总体转移率为5.3%,其中1例为低度恶性叶状肿瘤,占研究中所有低度恶性叶状肿瘤的1.1%;3例为中度恶性叶状肿瘤,占研究中所有中度恶性叶状肿瘤的3.9%;6例为高度恶性叶状肿瘤,占研究中所有高度恶性叶状肿瘤的26.1%。经统计学分析发现年轻（P=0.033）、肿物更大（P=0.032）、近期快速增长史（P=0.047）以及恶性等级（P<0.001）与远处转移密切相关且具有统计学意义。多因素分析调整后发现恶性等级（P<0.001）、近期快速增长史（P=0.029）与肿物侧别（P=0.046）对恶性叶状肿瘤的转移有影响。9、对所有恶性叶状肿瘤进行无病生存、无转移生存及总生存的生存分析。对188名恶性叶状肿瘤患者进行随访,随访时间15个月到251个月,中位随访时间为43.5个月。在无病生存的单因素生存分析中证明,肿物存在异源性化生成分（P=0.001）以及患者年轻（P=0.008）与患者不良的无病生存有关。选择局部广泛切除术的患者比选择乳房全切术的患者有更佳的无病生存时间（P=0.025）。进行多因素分析发现肿物具有异源性化生成分（P=0.003）以及年轻（P=0.012）为对患者无病生存影响的独立预后指标。对于无转移生存的单因素分析证明年轻（P=0.029）以及恶性等级（P<0.001）具有统计学意义,经多因素无转移生存分析发现,恶性等级（P<0.001）为独立预后指标。对于总生存的单因素以及多因素分析发现,恶性等级（P<0.001）为其独立预后指标。结论研究显示c-kit的间质阳性表达率随叶状肿瘤恶性程度升高而升高,二者正相关,而与之相反的是c-kit的上皮阳性表达率与叶状肿瘤恶性程度负相关。进一步两两比较显示c-kit间质阳性表达在良性与交界性、恶性叶状肿瘤之间具有明显差异且有统计学意义,而交界性与恶性叶状肿瘤之间不具有差异,与之前本课题组对叶状肿瘤进行比较基因组杂交实验的结果一致。在叶状肿瘤中c-kit间质表达阳性与KIT基因拷贝数增加有明显相关性,KIT基因拷贝数增加可能在叶状肿瘤恶性进程中起到一定的作用。恶性叶状肿瘤的恶性分级与其转移和死亡的不良预后明显相关,在临床诊断与应用中,应推广恶性叶状肿瘤的恶性分级系统。对恶性叶状肿瘤进行无病生存、无转移生存和总生存分析发现肿物过大、患者年轻以及肿物存在异源性化生成分时提示预后不良,应予以注意。恶性等级为患者在无转移生存以及总生存分析中的独立预后指标,而肿物中具有异源性化生成分以及患者年轻是对恶性叶状肿瘤无病生存期产生影响的因素。