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上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)(下文简称卵巢癌或EOC)发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第3位,但死亡率最高。随着我国社会人口老龄化,EOC发病逐渐升高。EOC发病无特异性症状,无有效早期筛查方法,且易发生种植与转移,临床中70%患者诊断为晚期卵巢癌,5年生存率仅30%左右。因此,EOC转移、侵袭机制是当前研究热点与难点。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是近年新发现一类非编码RNA,长度大于200个核苷酸。过去往往认为Inc RNA是“噪音”,无生物学功能。越来越多研究证实,Inc RNA可以从多个方面调节基因表达,如表观遗传学、转录水平及转录后调控,从而参与体内多种生物学过程,如:基因组印记/蛋白质/染色体沉默/转录激活/染色质修饰/转录干扰/核内运输等,参与人类多种疾病发生、发展,特别是肿瘤转移与进展。最近研究证实lnc RNAs也是细胞压力重要调节因子,调控细胞应急反应。压力诱导相关lnc RNAs和癌症侵袭及转移密切相关。应激诱导长链非编码转录本5(long stress-induced noncoding transcript5,LSINCT5)是压力应急与癌症相关lnc RNA家族成员之一,是正常人支气管上皮细胞(Human Bronchial Epithelial Cells,NHBE)接收烟草中4-(甲基亚硝氨)-1-(3-吡啶基)(Nicotine-derived nitrosamine ketone,NNK)刺激产生。研究证实,在乳腺癌与胃癌中LSINCT5表达明显增加,其表达与胃癌预后相关。Silva等发现,LSINCT5在乳腺癌和卵巢癌中表达均升高,同时能促进乳腺癌及卵巢癌细胞的增殖,然而,LSINCT5表达水平与EOC临床病理因素及预后关系,在侵袭/转移中作用及机制并不无相关研究。因此,我们将探索LSINCT5在EOC细胞及组织中表达,分析与临床病理及预后关系。进一步通过体外实验探索在卵巢癌侵袭/转移作用及机制。第一部分LSINCT5在卵巢癌中表达及预后分析1目的研究LSINCT5在EOC组织及细胞中表达情况,并分析与临床病理因素及预后关系。2方法2.1提取30例正常卵巢组织及40例EOC组织总RNA,采用qPCR法检测LSINCT5在两者中表达差异性;采用qPCR检测SKOV3,OVCAR3和3AO细胞株中LSINCT5表达情况。2.2采用qPCR法分析LSINCT5在EOC组织中表达水平与临床病理因素(年龄、FIGO分期、病理分级、组织学类型、残留病灶大小、淋巴结转移)相关性;采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)探讨LSINCT5诊断EOC特异性及敏感性。2.3采用生存分析方法分析EOC组织中LSINCT5表达水平与患者预后关系。3结果3.1 qPCR结果显示,LSINCT5在EOC组织中表达水平显著高于正常卵巢组织(P<0.01)。3.2 LSINCT5在SKOV3细胞中表达水平最高,高于OVCAR3和3AO细胞株(P<0.05)。3.3 LSINCT5在EOC组织中表达水平与淋巴结转移、FIGO分期有关(P<0.05)。但与患者年龄、组织分化、组织类型及是否满意减瘤无相关性(P>0.05);LSINCT5在EOC组织中诊断卵巢癌ROC曲线下面积0.927,其相对表达最佳临界点23.7133,敏感性80%,特异性93%。3.4单因素分析结果显示,LSINCT5表达水平与患者无进展生存期(Progression-free survival,PFS)相关(P=0.028),而与总生存期(Overall survival,OS)无明显相关性(P=0.336);多因素回归分析显示,LSINCT5表达水平(95%CI 1.411-9.966)及残留病灶大小(95%CI 0.53-1.116)为影响EOC患者PFS的独立预后因素,LSINCT5高表达患者肿瘤进展风险为低表达4.826倍;不满意减瘤患者肿瘤进展风险为满意减瘤4.114倍。FIGO分期(95%CI 0.570-13.426)、残留病灶大小(95%CI 0.220-2.77)为影响EOC患者OS的独立预后因素。4结论LSINCT5可能参与EOC侵袭及转移、影响患者预后。第二部分LSINCT5对卵巢癌恶性进展影响1目的探讨敲低LSINCT5表达对卵巢癌恶性生物学行为影响2方法2.1利用基因干扰技术敲低LSINCT5表达,将si LSINCT5特异性干扰序列转染至SKOV3细胞,筛选转染效率最高的序列。2.2采用CCK-8法检测si LSINCT5后SKOV3细胞增殖变化;流式细胞术检测si LSINCT5后SKOV3细胞凋亡变化;细胞划痕实验以及Transwell小室实验分别检测si LSINCT5后SKOV3细胞的迁移能力及侵袭能力变化。3结果3.1 2对si-LSINCT5序列中,LSINCT5-si RNA-1序列干扰效率明显高于LSINCT5-si RNA-2(P<0.001),选择LSINCT5-si RNA-1作为后续实验干扰序列。3.2 CCK-8实验结果显示,与si-NC组比较,si-LSINCT5组细胞增殖能力明显降低(P<0.05);细胞调亡结果显示,与si-NC组比较,si-LSINCT5组细胞凋亡无明显变化(P>0.05);划痕实验结果显示,与si-NC组比较,si-LSINCT5组细胞迁移能力降低(P<0.05);Transwell小室结果显示,与si-NC组比较,si-LSINCT5组细胞侵袭能力明显降低(P<0.05)。4结论敲低LSINCT5表达后,抑制SKOV3细胞恶性生物学行为。第三部分LSINCT5调控卵巢癌细胞恶性进展机制研究1目的探索LSINCT5调控卵巢癌恶性生物学行为分子机制。2方法2.1采用基因芯片筛选si-LSINCT5的SKOV3细胞差异基因;生物信息学预测LSINCT5调控潜在靶基因。2.2采用qPCR及免疫印迹技术分别检测si-LSINCT5的SKOV3细胞CXCR4m RNA及蛋白表达变化。2.3采用免疫组化技术检测CXCR4在EOC组织中表达并分析和临床病理因素关系。2.4采用qPCR技术检测EOC组织中LSINCT5表达与CXCR4的相关性。2.5采用CCK-8法检测加入CXCR4唯一配体CXCL12因子后对si-LSINCT5-SKOV3细胞增殖影响;划痕实验和细胞小室实验分别检测CXCL12因子对si-LSINCT5-SKOV3细胞的迁移与侵袭能力影响。3结果3.1芯片结果显示,si-LSINCT5与si-NC两者比较,总共筛选784个差异基因(筛选条件:Flod change≥2,P﹤0.05),其中上调2倍以上基因159个,下调2倍以上基因625个。LSINCT5靶基因预测,cis作用0个,trans作用248个。其中芯片筛选表达差异2倍以上基因和生物信息分析靶基因交集为CXCR4。3.2与si-NC组比较,si-LSINCT5组细胞CXCR4基因及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。3.3在EOC组织中,CXCR4蛋白表达阳性率为80%(32/40),显著高于正常卵巢表达13.3%(4/30)(P<0.01)。阳性染色主要定位于胞浆。分析CXCR4表达水平与患者年龄、FIGO分期、组织分化、淋巴结转移关系,结果显示:CXCR4在淋巴结阳性患者中的表达高于阴性患者(P<0.01);CXCR4在LSINCT5高表达组织中表达明显高于低表达患者(P<0.05);CXCR4表达与患者年龄、组织分化、FIGO无明显相关性(P>0.05)。3.4 Pearson相关分析显示,在EOC组织中,LSINCT5的表达与CXCR4表达呈正相关性(r=0.613,P=0.00)。3.5在si-LSINCT5的SKOV3细胞培养液中加入CXCL12因子,CCK-8实验显示细胞增殖能力增加(P<0.05);细胞划痕实验显示细胞迁移能力增加(P<0.05);Transwell实验显示细胞侵袭能力增加(P<0.05)。4结论LSINCT5通过CXCR4/CXCL12轴调控卵巢癌细胞增殖、侵袭及转移,为潜在治疗靶点。