高温驯化瑞士乳杆菌代谢补偿的变化研究

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瑞士乳杆菌(Lactobacills helveticus)属于乳酸菌,是一种无芽孢、杆状的革兰氏阳性细菌,广泛应用于食品、医学等领域。高温易引发乳酸菌的蛋白质变性、细胞膜结构损伤和酶活性的丧失等,严重影响菌体的活力。因此本课题研究了瑞士乳杆菌NCUF 210.1在高温驯化后的代谢补偿和转录组水平变化,对高温驯化后瑞士乳杆菌的细胞膜的流动性和通透性、渗透调节物质(海藻糖,可溶性蛋白)和抗氧化酶活性进行分析;并通过转录组测序,从分子层面探究高温驯化后瑞士乳杆菌的代谢补偿机制,最后探究了由高温驯化菌株经喷雾干燥制备的菌粉中瑞士乳杆菌的活菌数、模拟胃肠消化和储藏等相关性质。论文主要研究结果如下:(1)高温驯化后瑞士乳杆菌NCUF 210.1代谢补偿的变化:以瑞士乳杆菌NCUF210.1为研究对象,对其高温驯化后菌株的生长曲线、细胞膜通透性和流动性、可溶性蛋白含量、海藻糖含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性多个指标进行测定,对高温驯化后瑞士乳杆菌的代谢补偿变化进行探究。结果表明,与对照组(42℃)条件下相比,高温驯化(47℃)后瑞士乳杆菌的生长受到明显的抑制(p<0.05);细胞膜流动性降低;膜通透性提高;可溶性蛋白含量提高了140.13%(10 h)(p<0.05);海藻糖含量提高了17.23%(10 h)(p<0.05);SOD活性提高了159.28%(10 h)(p<0.05)。表明高温可能会使瑞士乳杆菌细胞膜膜蛋白结构和膜脂组成发生变化,导致细胞膜的通透性增加,可能促进一些维持细胞正常生长的钾盐、磷酸盐等小分子以及蛋白质等生物大分子物质泄漏。此外经高温驯化后瑞士乳杆菌海藻糖含量升高,从而保护细胞抵抗不良环境的影响。与对照组相比,瑞士乳杆菌在高温驯化(47℃)后耐酸能力分别增加了9.43%(8 h)、17.71%(10 h)和37.82%(12 h);耐胆盐能力分别提高了6.26%(8 h)、6.31%(10 h)和6.25%(12 h);耐热能力分别增加了41.91%(8h)、43.06%(10 h)和35.96%(12 h)。这可能是由于细胞内热应激调控机制通过增加应激基因的转录水平引起的代谢补偿,增强瑞士乳杆菌对酸、胆盐和高温等不同胁迫条件的抗性。通过扫描电镜观察得知,经高温驯化后,瑞士乳杆菌的菌体变长,出现了明显的形态变化,这可能是由于在胁迫条件下菌体细胞内代谢调控机制发生了一定的变化,以增强菌株的抗逆能力。(2)高温驯化后瑞士乳杆菌NCUF 210.1转录组水平的变化:分别对(对照组)和经高温驯化(实验组)培养10 h的瑞士乳杆菌NCUF 210.1进行原核生物转录组测序,以期从分子水平探究高温驯化瑞士乳杆菌的代谢补偿机制。结果表明,与对照组(42℃)相比,高温驯化(47℃)下的瑞士乳杆菌中有432个基因的调控模式发生变化,其中有219个基因转录水平上调,213个基因转录水平下调。GO功能分类分析显示,细胞组分类别中,差异表达基因集中在细胞构造(cellular anatomical entity)和蛋白复合物(protein-containing complex)等细胞组分。KEGG通路分析显示,与膜运输有关的上调差异表达基因为6个。表明经高温驯化后瑞士乳杆菌的细胞膜相关基因转录水平发生变化,从而使瑞士乳杆菌对高温环境具有更好的适应性和抵抗性。KEGG通路分析显示,经高温驯化后瑞士乳杆菌的氨基酸代谢、糖代谢和核苷酸代谢等代谢途径相关基因的转录水平提高,为菌株抵抗高温胁迫提供能量,增强组织细胞合成能力,从而增强其代谢补偿效应,以抵抗高温造成的细胞损伤。经高温驯化后瑞士乳杆菌中热休克蛋白相关基因dna K、dna J、gro L和rec A的表达量也出现上调,蛋白互作网络分析结果表明热休克蛋白可以通过调控细胞内的代谢活动来增强菌体的热耐受性。(3)高温驯化后的瑞士乳杆菌NCUF 210.1喷雾干燥制备成的菌粉性质分析:采用经高温驯化后的瑞士乳杆菌NCUF 210.1,进行喷雾干燥制得瑞士乳杆菌菌粉。瑞士乳杆菌菌粉的粒径分布均在100~400 nm,呈均匀分布。当进风温度为110℃时,经喷雾干燥制得的菌粉中水分含量高于进风温度为120℃和130℃。当进风温度为120℃时,瑞士乳杆菌菌粉中水分含量与进风温度为130℃时没有显著性差异(p>0.05)。与对照组相比,经高温驯化后的瑞士乳杆菌NCUF 210.1制得菌粉中活菌数分别提高了0.61 log cfu/g(进风温度为110℃)、0.62 log cfu/g(进风温度为120℃)和0.92 log cfu/g(进风温度为130℃)。这表明,经高温驯化后的瑞士乳杆菌NCUF 210.1对在喷雾干燥过程中的恶劣环境的抵抗能力增强。当进风温度为120℃,水分含量较低,活菌数较高,选择此组进行模拟胃肠消化和贮藏稳定性实验。在经模拟胃肠液消化180 min后,对照组和实验组中瑞士乳杆菌活菌数分别降低了4.06 log cfu/g和3.85log cfu/g。在4℃、25℃和37℃不同贮藏条件下,经高温驯化后的瑞士乳杆菌制备的菌粉在储存过程中的活菌数高于对照组。在4℃条件下储藏28 d,瑞士乳杆菌菌粉中活菌数降低较慢,稳定性更好,损失较少,有利于瑞士乳杆菌的长期储藏。
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