新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株引起的给世界养禽业造成极大危害的烈性传染病。迄今为止,已经在250多种鸟类以及少数的哺乳动物上发现了NDV的感染。为了适应庞大的宿主类型,与其它单股负链RNA病毒一样,NDV通过基因突变产生了大量的变异体,表现在多种多样的基因型。除宿主因素外,NDV的毒力主要是由其基因编码的膜融合蛋白（Fusion protein,F）裂解位点（Cleavage site,cs）决定的。虽然,基因Ⅵ型NDV的Fcs为强毒株类型,但有些毒株在鸡上表现出弱毒株特性,这表明基因Ⅵ型NDV的毒力可能受到其它毒力因子的影响。基因Ⅵ型NDV是一类宿主和抗原变异的病毒,易感宿主是鸽子,与用来生产并免疫我国家禽的ND疫苗的基因II型或ⅥI型NDV的同源性不高,常用的ND疫苗在鸽子上仅能提供部分保护。目前,缺少针对基因Ⅵ型的ND疫苗用以防控鸽子被NDV感染。因此,开展基因Ⅵ型NDV毒力的研究,并在此基础上研发针对该基因型的ND弱毒疫苗,对鸽源NDV的防控具有重要意义。本研究具体实验内容及结果如下:1.两株毒力差异较大的同源NDV毒株的生物学特性比较为了获得自然突变致弱的NDV毒株,实验室前期将一株分离自朱鹮的、中等毒力的基因Ⅵ型NDV毒株（CI10）在鸡胚中进行连续传代,多次传代后,发现传代株（CE16）的致病能力显著降低。为了对传代株有更加清楚的了解,本研究对CE16的生物学特性和致病性进行了全面的分析;与CI10相比,CE16产生的蚀斑大小缩小了约50%;在细胞上的增殖能力降低至原来的1/30;致病指数ICPI由1.04降至0.35,MDT由86 h延长至120 h以上;对鸡的致病性试验也显示CE16未能引起明显的临床症状,死亡率由100%降至0。为了进一步研究上述生物学表型及毒力改变的分子机制,本研究对两株毒株的全基因组序列进行了测序分析。结果显示,两毒株全长均为15192个核苷酸（Nucleotide,nt）,F蛋白序列完全一致且含有强毒株特征的Fcs。根据F基因的系统发育分析,两株毒株均属于基因Ⅵ型NDV。分子特征比较发现,与CI10相比,CE16基因上有6个nt的替换导致5个氨基酸（Amino acid,aa）的突变,这些突变位点分布于核衣壳蛋白（Nucleoprotein,NP）（A426T）、HN蛋白（A215G和T430A）以及聚合酶蛋白（Large polymerase protein,L）（E1694V和R1767G）。鉴于HN蛋白与NDV膜融合活性有关,而NP和L与病毒的增殖活性有关。推测上述表型差异的原因是由这5个位点上氨基酸的突变导致的。进一步的蛋白质3D结构模型预测分析发现:HN215的突变未引起明显的结构改变;HN430的突变使序列结构由β折叠变为无规则卷曲;L1694的突变显著改变了蛋白质结构;L1767的突变将α螺旋变成无规则卷曲。尽管NP426位没有相应的蛋白结构,但其位于NP蛋白中影响NP和磷蛋白（Phosphoprotein,P）互作的不规则区域内。上述结果为研究NDV毒力的分子机制提供了参考。2.基因Ⅵ型NDV CE16株反向遗传操作系统的构建为了研究CE16毒力减弱的分子机制以及研制基因Ⅵ型NDV弱毒活疫苗候选株,本研究以在鸡胚上连续传代致弱产生的NDV CE16株为骨架,构建基于T7启动子的基因Ⅵ型NDV反向遗传操作系统。首先,本研究选择经过改造的用于NDV拯救的克隆载体p BR322作为骨架载体,将病毒基因组全长c DNA分为8个不同带重复序列的亚基因片段,并采用酶切连接的方法,在该载体上成功组装出病毒的c DNA全长。为了获得精确的病毒全基因组序列末端,本研究分别在基因组c DNA的5’端引入T7 RNA聚合酶启动子、在3’端引入丁型肝炎病毒（Hepatitis delta virus,HDV）RNA核酶序列以及T7 RNA聚合酶终止子,构成NDV CE16全基因组c DNA的克隆质粒p BR322-CE16。同时将CE16株的NP、P和L的编码区序列克隆至p CAGGS表达载体上构建辅助质粒p CAGGS-NP、p CAGGS-P以及p CAGGS-L。最后,将上述构建好的全长c DNA质粒和三个辅助质粒共转染人喉表皮样癌（Hep-2）细胞,同时感染能够表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒（MVA-T7）。培养4天（dpi）后,分别收集细胞上清液及细胞,接种SPF鸡胚中进一步扩大培养,并利用血凝试验（Hemagglutination assay,HA）检测病毒滴度。经过上述方法,本研究成功获得了一株r CE16重组毒株,在鸡胚中连续传至10代后,仍具有良好的遗传稳定性。与CE16相比,r CE16在合胞体形成以及细胞中的增殖动力学均未发生明显改变;ICPI和MDT由原来的0.35和>120 h变为0.33和>120 h,毒力也未发生明显变化。因此,上述结果表明本研究成功构建了基于T7启动子的基因Ⅵ型NDV反向遗传操作体系,为后续研究NDV毒力的分子机制以及弱毒活疫苗提供了技术手段。3.利用反向遗传操作技术鉴定HN蛋白新毒力位点NDV的HN蛋白是影响毒力及致病性的重要毒力因子。为了研究CE16毒株HN蛋白上aa 215和aa 430的突变在NDV生物学特性及致病性改变中的作用。本研究首先构建了wt CE16、wt CI10、G215A及A430T的野生（wild type,wt）以及单位点突变HN蛋白。对4种HN蛋白表达效率、红细胞的吸附（Hemadsorption,HAd）能力、神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）活性、促细胞膜融合活性以及促F蛋白裂解能力等生物学功能进行评价分析。结果显示,4种HN蛋白在细胞表面的表达效率基本一致,表明氨基酸的突变未对HN的表达产生影响。其它生物学研究发现,与wt CE16相比,A430T和wt CI10的HAd活性分别降低了27.5%和29.9%、NA活性分别升高了78.3%和95.5%、融合指数分别增加了56.6%和66.3%、F蛋白裂解指数也分别增加了40.9%和51.4%。而G215A的HAd活性升高了19.6%、NA活性升高了17.9%、融合指数增加了12.9%、F蛋白裂解指数增加了5%,但未产生显著的差异。上述结果从蛋白水平证明了HN430是影响HN生物学活性的一个重要功能位点。为了进一步研究HN430位对病毒的影响,本研究将A430T通过点突变的方式引入到p BR322-CE16中,构建p BR322-CE16-HNA430T。通过病毒拯救成功获得了r CE16-HNA430T,在鸡胚中连续传至10代后,仍具有良好的遗传稳定性。与r CE16相比,r CE16-HNA430T重组毒株产生合胞体的能力增强了约40%、HAd能力增强了约50%、NA活性提高了约130%、增殖能力增强了约8倍左右。致病指数结果显示:ICPI由0.33升至1.38,MDT由>120h缩短至86 h;对鸡的致病性试验也显示r CE16-HNA430T能引起严重的临床症状以及100%死亡率,证明r CE16-HNA430T的致病性显著增强。因此,本研究鉴定到HN430位氨基酸位点是有别于已经鉴定过的在细胞膜融合、病毒增殖和致病性等方面有重要作用的新毒力位点。上述结果为HN蛋白功能位点的研究奠定了基础。4.利用反向遗传操作技术构建基因Ⅵ型NDV弱毒活疫苗候选株目前,鸽子上常用的ND疫苗为鸡用的传统疫苗,与鸽子中流行的基因Ⅵ型NDV遗传距离约为20%。虽然NDV只有一个血清型,但基因型和抗原的不匹配使得传统疫苗不能完全防控流行株的感染和扩散。因此,为了研究专门针对鸽流行NDV毒株的弱毒活疫苗,本研究利用基因Ⅵ型NDV CE16弱毒株为研究对象,通过反向遗传操作技术将p BR322-CE16的Fcs由强毒型的112RRQKR/F117替换为传统疫苗株La Sota的112GRQGR/L117。通过病毒拯救获得r CE16-La（Fcs）,F基因测序发现该毒株含有弱毒型Fcs序列,并且感染细胞后无合胞体形成。对拯救毒株的生物学特性、致病性和遗传稳定性检测发现:r CE16-La（Fcs）在鸡胚上具有良好的增殖活性,HA效价为29,病毒含量高于108EID50/m L;致病性结果显示ICPI由0.33进一步降低至0、MDT仍>120 h,表明Fcs的突变使该基因Ⅵ型传代弱毒株的毒力进一步降低;分别在鸡胚中连续传15代、在鸽子脑中传5代后测定鸡胚第5、10和15代次以及鸽子脑的第1、3和5代次病毒的毒力及Fcs序列,结果显示该毒株在鸡胚传代过程中毒力未发生明显改变（ICPI:0～0.05）,在鸽子中未引起任何临床症状,并且每代次病毒的Fcs序列均未发生回复突变,证明该毒株具有良好的毒力和遗传稳定性。为了验证r CE16-La（Fcs）的攻毒保护效率,本研究将该毒株和La Sota分别对鸽子进行一免和二免,然后对免疫后血清中抗体的产生、基因Ⅵ型强毒攻毒后的保护能力以及排毒情况进行检测。结果显示,r CE16-La（Fcs）免疫鸽子28 dpi后,对基因Ⅵ型强毒株抗原的HI效价约为211,而La Sota产生的HI效价约为28.5;在接种基因Ⅵ型强毒株后均未发生任何的临床症状或死亡,表明r CE16-La（Fcs）和La Sota具有相同的免疫保护效力;此外,对攻毒后口腔和泄殖腔拭子中病毒的检测发现,r CE16-La（Fcs）能显著降低拭子阳性率以及缩短排毒时间。综上所述,r CE16-La（Fcs）在鸡胚中具有良好的增殖活性,并且毒力和遗传稳定性均符合OIE疫苗株标准;此外,与La Sota相比r CE16-La（Fcs）在免疫后产生的血清抗体在同源毒株做抗原时能产生更强的中和抗体活性,并且在同源强毒株给鸽子攻毒后能产生更强的攻毒保护率。虽然传代次数较短不能保证r CE16-La（Fcs）的毒力是否会返强,但根据前面的研究结果,只要Fcs和HN蛋白430的氨基酸不同时发生突变,就能确保该r CE16-La（Fcs）为弱毒株。因此,相比其它只突变了Fcs的基因Ⅵ型的弱毒疫苗株,本研究研发的疫苗候选株可能更稳定,更适合用来生产弱毒疫苗。