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c-Myb作为血细胞分化成熟过程中的重要转录因子,与髓系细胞的的分化、增殖和凋亡有关。在多种恶性肿瘤中如白血病、结直肠癌和乳腺癌等,都发现了c-Myb的异常表达。尽管对人和鼠的白血病细胞中的c-myb调控机制已经有一定深度的研究,人白血病细胞中c-myb调控的机制还不清楚。c-myb在人体和小鼠及一些哺乳动物中参与血细胞生成与成熟,对血细胞分化也起重要作用。而c-myb精细的表达调控作用还不清楚。与c-myb表达相关的调控机制及调控相关的信号通路有需要更进一步的探索研究。c-Myb的过表达与人类T细胞急性淋巴细胞白血病相关。在降低c-Myb表达的小鼠中发现了造血干细胞数量明显增加的现象。虽然在敲除c-myb后的小鼠血液中发现髓系细胞如红细胞和巨核细胞的占有比例有增长现象,但是按照绝对数值比较其数量还是呈现显著下降趋势。基于c-myb在血细胞分化成熟及白血病生成过程中的重要作用,对于人白血病细胞中c-myb调控机制的研究具有重要意义。本实验以人白血病细胞作为研究主体,探究人红白血病K562细胞、人急性髓系白血病U937细胞、人早幼粒急性白血病HL60细胞中转录因子GATA1、GATA2、CTCF、TAL1、PU.1、C/EBPβ、Rad21、c-Jun对c-myb的表达调控。首先我们用100μg/L TPA(12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)诱导U937细胞72 h,用40μmol/L Hemin(氯高铁血红素)诱导K562细胞24 h,用2μmol/L ATR A(全反式维甲酸)诱导HL60细胞72 h。诱导后检测这些转录因子及c-myb的表达变化,发现GATA1、c-Jun、TAL1、C/EBPβ的表达与c-myb表达同时发生改变,意味着GATA1、c-Jun、TAL1、C/EBPβ可能与c-myb的表达有所关联。并用Ch I P-q PCR实验检测到K562细胞分化前后c-Jun在-34K、-88K的富集发生了明显的变化,说明转录因子c-Jun对c-myb的作用与-34K、-88K这两个c-myb上游远端增强子有关。我们克隆出GATA1基因并成功构建了p LVX-IRES-GATA1慢病毒表达质粒;同时设计了GATA1、TAL1、c-Jun、GATA2、CTCF、PU.1、Rad21转录因子的sh RNA敲降质粒并构建到p LKO.1质粒上形成p LKO.1-GATA1 sh RNA、p LKO.1-TAL1 sh RNA、p LKO.1-c-Jun sh RNA、p LKO.1-GATA2 sh RNA、p LKO.1-CTCF sh RN A、p LKO.1-Rad21 sh RNA、p LKO.1-PU.1 sh RNA质粒。我们用双荧光素酶报告系统检测了GATA1转录因子在-34Ka(我们将-34K区段划分为a、b、c三个片段形成-34Ka、-34Kb、-34Kc)及-88K区对c-myb promoter表达的影响。用293T细胞包装生产具有感染效率的慢病毒,感染K562和U937细胞,并用Western blo t和RT-q PCR检测c-myb和转录因子的表达情况。实验得出:(1)Western blo t结果显示K562细胞经过Hemin诱导后c-Jun、TAL1、C/EBPβ表达明显上升,G ATA1的表达明显下降,c-Myb表达明显下降;Ch IP-q PCR显示诱导分化后K562细胞中c-Jun结合在c-myb promoter、-34kb、-88kb区域均下降;(2)Wester n blot结果显示U937细胞经过TPA诱导后,c-Jun表达明显上升,GATA1表达明显下降,c-Myb表达明显下降;(3)Western blot结果显示HL60细胞经过AT RA诱导后C/EBPβ表达明显上升,GATA1表达明显下降,c-Myb表达明显下降;(4)RT-q PCR和Western blot结果显示成功过表达GATA1的K562细胞中,c-M yb表达也同时提高;RT-q PCR结果显示成功敲降GATA2、CTCF、PU.1、Rad21、T AL1、c-Jun的K562细胞中,c-myb表达随之下降。(5)RT-q PCR和Western bl ot结果显示成功过表达及敲降GATA1的U937细胞中,c-Myb表达也同时升高和降低;(6)双荧光素酶报告系统检测显示GATA1能促进c-myb promoter的表达。综上所述,本实验通过用诱导剂对白血病细胞K562、U937、HL60诱导分化检测c-myb与转录因子GATA1、GATA2、CTCF、PU.1、Rad21、TAL1、c-Jun的表达变化,设计转录因子的表达质粒和敲降质粒,利用慢病毒包装感染技术在白血病细胞中敲降或过表达转录因子来进一步探索转录因子对c-myb的调控作用,用双荧光素酶报告系统进一步确认GATA1对c-myb的调控作用,和用Ch IP-q PCR技术探究了c-Jun在c-myb上游远端调控位点的结合情况。以上结果表明GATA1在K562和U937细胞中对c-myb的表达具有促进作用,GATA1在HL60细胞中可能有促进c-myb表达的作用。在K562细胞被诱导分化后的c-Jun、TAL1、C/EBPβ表达明显上升c-myb表达下降,而在K562细胞中敲降这些转录因子后c-myb随之下降的现象,目前只能说明c-Jun、TAL1、C/EBPβ在K562细胞中与c-myb的表达是有关联的,具体的关联机制还有待更深入的研究。GATA2、CTCF、PU.1、Rad21则可能在K562细胞中能够促进c-myb的表达。基于c-myb基因在白血病和其他癌症当中重要的作用和这些转录因子对c-myb的表达调控机制,本研究可为白血病研究方案和治疗提供新的思路。