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锌铁转运蛋白(ZIP)广泛存在于植物、细菌、真菌及动物中,其成员大都具有8个跨膜结构域,在金属离子从细胞外至细胞内的转运过程中以及金属离子细胞内的运输过程中都发挥重要的作用。 西洋菜营养丰富,具有一定的食用价值和药用价值,对癌症及慢性疾病有一定的抵抗作用。同时,西洋菜在富营养化的水体中也能良好生长,可用来净化水质。通过对西洋菜锌铁转运蛋白基因的克隆,旨在了解该基因在西洋菜生长发育过程中的生物学功能,同时分析西洋菜在不同培养条件下锌铁转运蛋白基因的表达情况,为西洋菜的合理种植和栽培奠定了一定基础。 本文以水稻、玉米等与西洋菜亲缘关系较近的多种植物的ZIP基因保守序列设计简并引物,以西洋菜根部RNA反转录的cDNA为模板通过两步RT-PCR法扩增出西洋菜ZIP的保守序列片段,利用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术,得到完整的NoZIP1和NoZIP3基因(Nasturtium officinale R.Br.ZRT,IRT-like protein)。NoZIP1基因cDNA全长1239bp,5’-URT长53bp,3’-URT长115bp,包含完整的阅读框(54-1124bp),编码356个氨基酸。预测的多肽分子量为38.116KD,等电点为6.45。NoZIP3基因cDNA全长1454bp,5’-URT长102bp,3’-URT长323bp,包含完整的阅读框(103-1131bp),编码342个氨基酸。预测的多肽分子量为36.5199KD,等电点为7.15。氨基酸序列和结构分析显示NoZIP1和NoZIP3都为疏水蛋白,含9个跨膜区。亚细胞定位预测NoZIP1和NoZIP3分泌途径均为S型,定位在分泌通路。对NoZIP1和NoZIP3蛋白的结构域进行分析显示,NoZIP1和NoZIP3蛋白分别在第49-353位、第51-339位之间是个高度保守的结构功能域,即ZIP家族成员共有的典型结构域。通过BLAST分析及系统进化树构建可知NoZIP1氨基酸序列与荠蓝相似性达90%,NoZIP3氨基酸序列与荠蓝和拟南芥等十字花科植物相似性均达到89%。 本实验通过荧光定量PCR检测不同培养条件下西洋菜根和叶中锌铁转运蛋白的表达情况,试验结果显示在根和叶中,不同锌铁离子浓度下NoZIP1和 NoZIP3的表达模式略有差别,但都能受到缺锌和缺铁的胁迫而诱导表达。 用酵母菌功能互补实验表明,NoZIP3可以互补锌缺陷型酵母菌的功能,但不能互补铁缺陷型酵母菌的功能。表明该基因能转运锌,但不能转运铁。