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目的:原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是具有血管富集性的恶性肿瘤，其生长、转移与血管生成有密切的相关性。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是体内一种强有力的促血管生成因子，通过与VEGF受体(VEGFR)结合，将引起一系列信号传导，释放各种生长因子和细胞因子，同时促进内皮细胞的增殖和迁移，直接或间接参与血管生成。在肝癌的发生、发展及预后中具有极其重要的地位。本研究通过筛VEGF(vascular endothelial growth factor)和VEGFR(vascularendothelial growth factor receptor)均高表达的肝癌细胞，深入研究板兰根双糖Fructopyrano-(1→4)-glucopyranose(FG)靶向VEGF/VEGFR信号通路对肝癌细胞增殖和血管生成的影响，旨在进一步阐明FG靶向VEGF/VEGFR信号通路抑制肝癌细胞增殖和血管生成机制，为FG在肿瘤治疗中的应用提供科学的实验依据。 方法:(1)筛选VEGF和VEGFR高表达的肝癌细胞株:体外培养人肝癌细胞株Bel-7402、HepG2和SMMC-7721，然后采用免疫细胞化学法检测三种细胞的VEGF、Flt-1、KDR的表达情况，酶联免疫吸附试验法(Enzym e-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测细胞培养上清液中VEGF的浓度，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR: ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction)技术检测细胞中VEGF mRNA的表达，筛选VEGF和VEGFR均高表达的肝癌细胞;(2) FG体外对肝癌细胞增殖和VEGF/VEGFR通路的影响:FG干预上述实验筛选出VEGF和VEGFR高表达的肝癌细胞株Bel-740248 h后，采用CCK-8试剂盒(cellcounting kit-8)方法检测细胞的增殖，计算半抑制浓度(IC50)。RT-PCR和western blot分别检测经FG干预肝癌细胞Bel-7402的VEGF、Flt-1和KDR的mRNA表达。(3)FG体外对新生血管生成的影响:FG干预人微血管内皮细胞HMEC细胞48 h后，采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖，计算IC50，Wounding healing assay测试FG对HMEC细胞迁移的影响，Tube formationassay观察FG对HMEC细胞小管形成的影响;(4) FG体内对Bel-7402裸鼠移植瘤生长和血管生成的影响:建立裸鼠Bel-7402移植瘤模型，观察FG对肿瘤生长、微血管密度(MVD)和VEGF表达的影响。 结果:(1)筛选VEGF和VEGFR高表达的肝癌细胞株:免疫组化检测HepG2和Bel-7402细胞均具有VEGF、Flt-1和KDR的表达，而SMMC-7721细胞则只具有VEGF和Flt-1受体的表达，而无KDR受体的表达。ELISA检测细胞培养上清液中VEGF蛋白的含量Bel-7402表达最多，SMMC-7721最少。RT-PCR方法检测，Bel-7402中VEGF mRNA表达最多，SMMC-7721的VEGF mRNA含量最少(t=6.928，F=0.000)，据此，本研究选定VEGF/VEGFR均高表达的肝癌细胞株Bel-7402作为实验用细胞。(2) FG体外对肝癌细胞增殖和VEGF/VEGFR通路的影响:FG能明显抑制Bel-7402细胞的增殖，随着浓度的增加（从62.5μM到1000μM），抑制作用增强。作用24 h，48 h，72 h后，FG对Bel-7402细胞的IC50分别为509.68±36.28μM、287.04±15.36μM、244.57±12.92μM。(3) FG体外对新生血管生成的影响:FG能明显抑制HMEC细胞的增殖，呈现出较好的浓度依赖关系，作用24 h，48 h，72 h后，对HMEC细胞的IC50分别为678.19±45.53μM、464.65±23.75μM、416.39±22.72μM。Wounding healing assay检测发现FG在125μM时即表现出抑制HMEC细胞迁移的作用，迁移的细胞数随着FG浓度的增加而减少，与阴性对照组比较差异有显著性(P＜0.05);Tube formation assay观察发现，FG能抑制HMEC细胞小管形成，且随着浓度的增加，HMEC细胞小管形成明显减少。(4) FG体内对Bel-7402裸鼠移植瘤生长和血管生成的影响:FG不同程度抑制裸鼠移植瘤的生长，各治疗组给药后TV、RTV和T/C％明显下降。SABC法结果显示，FG治疗组呈棕褐色条索状，微血管分布较稀疏，MVD值不同程度降低，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。免疫组化结果显示，阴性对照组瘤组织中有大量的VEGF表达，胞浆呈现不同程度的棕黄色颗料，FG治疗组能明显减少VEGF的阳性表达，阳性表达率低于阴性对照组，差异有统计学意义(P＜0.0l)。 结论:Bel-7402细胞存在VEGF和VEGFR高度表达，表达强于HepG2和SMMC-7721细胞，可作为靶向VEGF/VEGFR信号通路抑制肝癌血管生成的细胞筛选体系。FG能明显抑制Bel-7402细胞的增殖，减少Bel-7402细胞VEGF、Flt-1和KDR的mRNA和蛋白表达，且呈现出较好的浓度依赖关系;FG明显抑制HMEC的增殖、迁移和小管形成，具有明显的体外抗血管生成作用。FG不同程度抑制裸鼠移植瘤的生长，降低肿瘤微血管密度MVD，减少瘤组织中VEGF的表达，初步揭示FG具有靶向VEGF/VEGFR信号通路抑制肝癌细胞增殖和血管生成的作用。