精子载体介导的转基因技术操作简单,成本低廉,自Lvaitran 1989年提出以来受到了人们的广泛关注。但是由于精子载体法精子存在在体外与外源DNA共孵育使精子活力下降影响与卵细胞结合使受精困难、外源DNA无法整合到动物细胞基因组等缺陷,很大程度上限制了精子载体技术的发展与应用。CRISPR/Cas9系统目前已经在众多研究人员实验结果中表现出强大的定点基因编辑能力,这一特点和精子载体法相结合制备基因编辑(基因突变)的遗传修饰的转基因动物具有一定的可行性。探讨将两个技术结合制备基因编辑鸡在目前转基因鸡制备技术尚不成熟的情况下,具有重要的意义。因此,本试验旨在通过以鸡生长激素受体基因(Growth hormone receptor,GHR)为模型,筛选出高效的sgRNA,建立精子载体脂质体孵育条件,将CRISPR/Cas9系统与精子载体技术结合,期望建立简单高效廉价的制备遗传修饰鸡的方法。主要研究内容及结果如下:高活性sgRNA体外酶切筛选:实验首先根据矮小型鸡生长激素受体基因缺失部分的外显子区用在线sgRNA设计软件设计5对sgRNA序列,并且分别构建出前边插入了 T7启动子的sgRNA的体外转录载体pT7-sgRNA-trac,转录出对应的sgRNA。按照Cas9体外酶切试剂盒说明书将Cas9蛋白、sgRNA和体外切割底物按比例混合孵育,酶切结果用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果:sgRNA1体外切割效率为82.1%,sgRNA2体外切割效率为57.4%,sgRNA3体外切割效率为92.5%,sgRNA4体外切割效率为33.7%,sgRNA5体外切割效率为95.4%。sgRNA活性的DF-1细胞内鉴定及sgRNA脱靶分析:选择靶向GHR基因体外酶切效率较高的sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5,构建出相应的sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表达载体。构建左右同源臂质粒载体pMD19T-zyb,将Neo R表达结构和左右同源臂连接构建打靶载体pMD19T-Neo-zyb。将sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表达载体分别和打靶载体共转染DF-1细胞,用G418筛选,挑单克隆细胞并且增殖培养,将所有阳性单克隆细胞基因组DNA通过PCR扩增鉴定NeoR定点插入,并且将鉴定未定点插入的单克隆细胞基因组通过PCR扩增GHR基因检测靶点处基因序列并进行测序鉴定靶位点处是否发生编辑,其中sgRNA1获得16株细胞克隆有2株为定点插入阳性,编辑效率为12.5%;sgRNA3获得23株细胞克隆有9株为定点插入阳性,2株为未定点插入但靶点序列发生突变,编辑效率为47.8%;sgRNA5获得24株细胞克隆有11株为定点插入阳性,2株为未定点插入但靶点序列发生突变,编辑效率为54.2%。根据在线脱靶分析软件设计对sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5分别选出5个潜在脱靶位点,并设计相应引物,以筛选到的所有Neo R抗性为阳性的细胞克隆基因组为模板PCR扩增出对应潜在脱靶位点序列并测序:分别选出的5个潜在脱靶位点均未检测到sgRNA发生脱靶。精子孵育条件建立:采集新鲜公鸡精液,取200μL精液,洗涤液同孵育液洗涤精清,孵育液分别为稀释液、DMEM培养基、1640培养基、PBS缓冲液,孵育时间分别为10min、30min、60min、90min,观察精子活力选择合适的孵育液,选择能维持精子较高活力的孵育液分别与pX330质粒共孵育10min、30min、60min、90min,观察精子活力并且以半定量PCR鉴定摄取外源DNA情况筛选出最优孵育时间;另一组试验为孵育前分别用0μL、1μL、1.5 μL、2 μL脂质体包被质粒DNA,孵浴时间60 min,半定量PCR鉴定摄取外源DNA情况及有活力的精子所占比例综合选择合适的脂质体体积;通过人工授精,比较不同孵育方法受精率,并PCR鉴定携带外源DNA的受精蛋胚盘数以确定最佳孵育方法。结果不同孵育液孵育后,M199培养液做为孵育液孵育后有活力的精子所占比例显著高于其他组(P<0.05),孵育时间60 min时为最佳孵育时间;脂质体孵育最佳的脂质体用量为1.5μL;普通孵育处理的受精率为51.18%,脂质体孵育处理的受精率为44.78%,差异不显著(P>0.05),简单孵育外源DNA 阳性率为14.94%,脂质体孵育外源DNA 阳性率28.89%,差异显著(P<0.05)。编辑胚胎或个体的鉴定:将DF-1细胞筛选高效的sgRNA、Cas9蛋白、EGFP共表达载体与精子在建立的合适孵育条件下脂质体共孵育,人工授精,第X期胚盘水平和刚出壳雏鸡组织水平检测基因编辑:第X期胚盘1087枚,鉴定出3枚受精蛋发生基因编辑,初步估计编辑效率为0.28%,发生基因编辑的3枚受精蛋中发生基因编辑细胞数分别占第X期总细胞数的比例初步估计为10.4%、12.5%、10.4%,经鸡胚基因组DNA进行PCR鉴定性别,发生基因编辑的3枚受精蛋均为雌性,推测CRISPR/Cas9系统发生基因编辑的时期在受精卵发育到8细胞期之前;雏鸡组织未鉴定出发生基因编辑的样品,导致的原因可能是多样的。本试验通过将筛选靶向GHR基因的高效sgRNA,建立适合鸡精子载体的孵育条件,将两者相结合,在第X期胚盘中实现了定点基因编辑,为矮小鸡制备建立了一个新的技术方法,同时也为其他基因编辑及甚至基因打靶的转基因鸡的制备提供了新的思路和方法。