神经损伤尤其是脊髓损伤后脑功能重塑研究是近年来国内外研究的热点,有研究发现脊髓损伤后大脑相关功能区会逐渐退变甚至被相邻功能区侵占,也有研究得到相反结果,大脑并没有出现退变反而出现功能重塑。脊髓损伤后究竟是什么机制调控大脑退变或功能重塑目前还不清楚。本课题组前期研究证实脊髓损伤后可利用损伤平面以上正常的神经根前后根移位和支配膀胱的骶神经前后根吻合同时重建膀胱的传入和传出通路,且术后大脑的储尿排尿相关功能区出现了可塑性变化,但大脑组织结构变化及分子水平机制仍不明确。因此本研究通过四部分动物实验观察脊髓损伤后脑桥排尿相关功能区退变过程的组织结构变化;重建膀胱-大脑神经传导通路来观察脑桥排尿功能区组织结构变化;观察脊髓损伤和膀胱功能重建术后脑桥排尿功能区退变及重塑过程中细胞凋亡分子水平变化;采用免疫荧光标记法观察脑功能重塑过程中活化星形胶质细胞的数量及其信号传导通路,以初步了解大鼠脊髓损伤膀胱功能重建术后脑功能重塑的机制,为临床促进神经移位重建脊髓损伤患者排尿或肢体功能的恢复奠定理论基础。第一部分 大鼠脊髓圆锥损伤后脑桥排尿中枢组织结构变化的实验研究目的观察大鼠脊髓圆锥损伤后大脑排尿相关功能区结构变化,探讨膀胱大脑相关功能区的退变规律。方法成年雌性SD大鼠35只,随机分为实验组（n=30）和对照组（n=5）。实验组将大鼠L4以下脊神经切断制作脊髓圆锥损伤模型,对照组不作任何处理。实验组于术后1日、1周以及1、3、6个月分别处死取材,取脑桥被盖背外侧部组织,行HE染色、光镜电镜观察。结果HE染色:在光镜下观察显示术后1天实验组和对照组无明显区别,神经元细胞密集,排列整齐,核仁清楚;实验组术后一周脑桥排尿中枢可见神经元细胞周围间隙稍增宽,部分神经元出现细胞核固缩,随着损伤时间延长,细胞核固缩的细胞越来越多,甚至部分细胞出现核消失。电镜观察显示实验组术后一周即可见神经元细胞体积变小,胞质加深,术后1月可见核染色质凝聚,边移;形成凋亡小体典型细胞凋亡表现,随着损伤时间延长可见凋亡小体细胞逐渐增多,细胞间隙增宽,未见明显新生神经细胞。结论大鼠脊髓圆锥损伤后脑桥排尿中枢发生神经细胞凋亡、退变形态学改变,并随着脊髓损伤时间延长逐渐加重,可观察到细胞间隙增宽,细胞消失,脑萎缩等改变。第二部分大鼠脊髓圆锥损伤膀胱功能重建术后脑桥排尿中枢组织结构变化的实验研究目的探讨大鼠脊髓圆锥损伤后行膀胱功能重建术对脑桥排尿中枢组织结构变化的影响。方法成年雌性SD大鼠30只,随机分为5个组,每只大鼠均先行脊髓圆锥损伤再行神经移位重建膀胱排尿功能手术,分别在术后不同时间处死取材,每组6只。脊髓损伤操作同前,膀胱功能重建术是将L4双侧神经根前后根与双侧S2前后根吻合。大鼠于术后1日,1周,1月,3月,6月分别处死取材。取脑桥被盖背外侧部组织,行HE染色、光镜电镜观察。结果术后1天、1周、1月各组在光镜及电镜下观察到细胞核、染色质固缩,线粒体空泡化,细胞间隙增大及凋亡小体等细胞凋亡、坏死变化,与脊髓损伤组表现类似。但术后3月及术后6月两组观察到神经细胞增多、活化状态星形胶质细胞增多等神经再生、功能重塑表现。结论大鼠脊髓圆锥完全损伤后重建膀胱神经传导通路可以引起脑桥排尿中枢神经修复,功能重塑,可观察到神经细胞增多,星形胶质细胞激活等表现。第三部分大鼠脊髓圆锥损伤和膀胱功能重建术后脑桥排尿中枢神经细胞凋亡及其机制实验研究目的建立大鼠脊髓圆锥损伤和脊髓损伤膀胱神经通路重建模型,观察术后不同时间点脑桥排尿中枢神经细胞凋亡计数及Bcl-2、Bax蛋白表达变化,探讨Bcl-2、Bax蛋白在脑桥神经细胞凋亡和重塑中的作用。方法65只成年雌性SD大鼠随机分为三组:A组,脊髓损伤膀胱功能重建组（30）,大鼠脊髓圆锥损伤后行神经移位重建膀胱排尿功能手术;B组,脊髓损伤组（30只）,仅行脊髓圆锥损伤手术。A组和B组再随机分为5个亚组,分别在术后不同时间（1日,1周,1,3,6个月）处死取材,A组、B组每组各6只。C组,正常对照组（5只）,不行特别处理。手术操作方法同前。取脑桥被盖背外侧部组织,免疫组织化学SP染色观察Bcl-2、Bax蛋白表达及TUNEL染色计算神经细胞凋亡数。结果C组（对照组）Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比较稳定,而B组（脊髓损伤组）术后一日即发生明显的Bcl-2和Bax的上升,Bax上升的幅度明显大于Bcl-2,Bcl-2/Bax比值显著下降,表明脊髓损伤后一日脑桥排尿中枢促凋亡基因占主导地位,细胞开始凋亡。术后一周后Bcl-2和Bax均进一步上升,Bax上升的幅度仍然大于Bcl-2,依旧是促凋亡基因为主,表明脊髓损伤后脑桥排尿中枢神经细胞持续凋亡,这与显微镜及电镜观察到细胞核固缩、染色质浓缩及线粒体空泡化等表现相符。术后1月Bcl-2和Bax均下降明显,但仍高于正常对照组;术后3月、6月各组,Bcl-2和Bax基本和术后1月相同。TUNEL染色结果也提示相对于对照组,实验组术后1日平均凋亡细胞数明显增多,而术后一周进一步增多达到顶点,术后1月,术后3月,术后6月平均凋亡细胞数基本稳定,但仍然高于对照组,这与Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax变化相一致。而神经重建组Bcl-2、Bax在术后1天、1周、1月各组平均阳性细胞数比例与脊髓损伤组相似,均为术后第一天即上升,术后1周达到顶点,术后1月开始下降。但在术后3月及术后6月两组BCL-2持续上升,而Bax进一步下降,导致Bcl-2/Bax比值持续上升。TUNEL试验神经重建组术后3月、6月平均神经细胞凋亡数明显低于脊髓损伤伤组,这与上述结果吻合。结论脊髓损伤后大脑神经细胞凋亡的原因是凋亡蛋白Bax的显著升高,术后1周是细胞凋亡的高峰时间点。神经重建术后3月、6月脑功能重塑的原因是Bcl-2再次升高和Bax降低。同时证明Bcl-2/Bax的比值是比较准确的判断神经细胞凋亡的方法,其变化与TUNEL实验结果相吻合。第四部分大鼠脊髓圆锥损伤膀胱功能重建术后脑桥排尿中枢星形胶质细胞变化及其信号通路的实验研究目的建立大鼠脊髓圆锥损伤和脊髓损伤膀胱神经通路重建模型,观察术后不同时间点脑桥排尿中枢活化星形胶质细胞数量及p P65,、p STAT3蛋白表达变化,探讨星形胶质细胞在脑功能重塑过程中的作用及其活化的信号通路。方法70只成年雌性SD大鼠随机分为三组:A组,脊髓损伤膀胱功能重建组（30）,大鼠脊髓圆锥损伤后行神经移位重建膀胱排尿功能手术;B组,脊髓损伤组（30只）,仅行脊髓圆锥损伤手术。A组和B组再随机分为5个亚组,分别在术后不同时间（1日,1周,1,3,6个月）处死取材,A组、B组每组各6只。C组,正常对照组（10只）,不行特别处理。手术操作方法同前。取脑桥被盖背外侧部组织,行免疫荧光GFAP染色,光镜下计数星形胶质细胞数量,免疫组化检测p P65,、p STAT3蛋白表达变化,Western-Blot检测星形胶质细胞GFAP蛋白,p P65、p STAT3蛋白表达,。结果C组（对照组）脑桥排尿中枢GFAP阳性星形胶质细胞较少。A组（神经重建组）和B组（脊髓损伤组）术后1日、1周和1月变化趋势基本相似,术后一日与对照组无明显区别,（P（29）0.05）;术后1周,A组和B组均升高明显,术后1月显著下降,B组恢复到对照组水平,而A组虽然也下降但仍维持高于对照组水平。术后3月、6月A组活化星形胶质细胞数量再次显著升高,而B组与前变化不明显。各组Western-Blot 检测结果提示GFAP蛋白表达与活化星形胶质细胞数基本吻合。NF-κB和STAT3信号通路检测发现:A组和B组术后1日、1周和1月变化趋势基本相似:术后1日、1周p P65和p STAT3均明显升高,术后1月p P65和p STAT3均明显下降。术后3月、6月A组p P65再次显著升高,p STAT3无明显变化,而B组p P65和p STAT3均与前变化不明显。结论脊髓损伤后脑桥功能结构重塑过程中活化的星形胶质细胞明显增多,脊髓损伤后一周星形胶质细胞反应性增多,这个过程持续时间较短,这与SCI损伤早期大脑急性炎性反应,NF-κB和STAT3信号通路激活,促进星形胶质细胞活化、增殖有关;神经重建组术后3月、6月星形胶质细胞再次增多与膀胱-大脑神经传导通路重建有关,NF-κB通路再次激活,其激活因子可能是神经营养因子,这需要进一步证实。