前言　　特应性皮炎(Atopicdermatitis，AD)是儿童皮肤病中最常见的一种慢性、复发性疾病，以皮肤瘙痒、干燥和炎症为特点，影响着全世界约20％的儿童，其中90％于5岁以内发病。AD作为一种皮肤疾患，不仅严重影响着患儿的身心健康，也给家长带来沉重的生活负担。近年来，AD患病率逐年上升。目前其发病机制尚不完全清楚，可能与遗传、免疫及微生物的感染有关。最近研究认为遗传性或获得性皮肤屏障功能障碍在AD发病中具有关键作用。皮肤屏障受损后，使过敏原易于侵入，从而引起免疫反应，反过来进一步打乱皮肤屏障功能的稳态。　　皮肤屏障功能缺陷包括表皮细胞终末分化蛋白质异常和细胞间脂质合成障碍。丝聚合蛋白(Filaggrin，FLG)、内披蛋白（Involucrin，INV）和兜甲蛋白(Loncrin，LOR)是三种重要的终末分化蛋白，它们的编码基因均位于人类染色体lq21区，是表皮分化复合物基因簇(Epidermaldifferentiationcomplex，EDC)的成员，在角质细胞终末分化过程中，它们形成坚韧的角质化套膜(Cornifiedenvelope，CE)，在维持皮肤屏障功能中发挥着重要作用。其中丝聚合蛋白具有关键作用。近年来发现，由于易感基因丝聚合蛋白的基因突变导致皮肤屏障结构障碍在AD的发病机制中是一个关键环节或启动环节。FLG不仅是重要的结构蛋白，而且FLG开始转录的产物为pro-FLG，pro-FLG从颗粒层进入角质层时，经过蛋白水解，加工成FLG，再经过蛋白水解变成氨基酸类物质，进一步转化为多羧酸类物质，如尿刊酸等，为天然保湿因子的主要来源。在这个代谢过程中，可将水分带到角质层，所以在角质层的水合作用中发挥重要作用。　　神经酰胺(Ceramide，CER)是一种生理性脂质，由板层小体合成和分泌，与胆固醇、游离脂肪酸一起构成复层板层膜充斥于角质细胞间隙，抑制水分的丢失，维持皮肤屏障功能。AD患者皮肤角质层中神经酰胺含量下降，透皮水分丢失增加，因此皮肤干燥、粗糙呈脱水状态，这是AD皮损脱屑、瘙痒的一种病理生理基础。外源性神经酰胺已经被普遍认为具有改善皮肤屏障功能作用，并且作为皮肤屏障修复剂的主要成分广泛使用。　　神经酰胺作为一种细胞间脂质，可能影响表皮细胞自身脂质成分的新陈代谢，但是否影响表皮终末分化蛋白的表达，尤其是丝聚合蛋白的表达，进而影响皮肤的屏障功能，文献上鲜有研究。　　本文以AD儿童为研究对象，通过免疫组化方法观察了其急性皮损处三种分化蛋白的表达情况，从皮肤屏障功能障碍方面进一步深入探讨了AD的发病机制。然后通过培养人角质形成细胞(Keratinocytes，KCs)和HaCat细胞，重点研究了神经酰胺2对以上三种相关终末分化蛋白表达的影响，以及神经酰胺对角质形成细胞板层小体合成的影响，借此探讨神经酰胺改善皮肤屏障功能的具体作用机制，为临床有效治疗和控制AD提供了一种新的治疗思路和理论基础。　　材料和方法　　一、研究对象　　AD患儿;人正常原代角质形成细胞和HaCat细胞。　　二、实验材料　　神经酰胺2，Epilife培养基，胎牛血清，EDTA，胰蛋白酶，CCK-8试剂盒，FLG、INV和LOR抗体，Trizol，cDNA第一链合成试剂盒，PCR扩增试剂盒，鼠抗人β-actin单抗，组织总蛋白提取试剂盒，BCA蛋白浓度测定试剂盒，2.5％戊二醛固定液等。　　三、实验方法　　1、通过环钻法获取AD患儿急性皮损处皮肤，以儿童正常皮肤作为对照，应用免疫组化方法研究FLG，INV和LOR的表达变化情况。　　2、培养正常人原代角质形成细胞和HaCat细胞，应用CCK-8试剂盒，检测不同浓度的神经酰胺2对细胞的毒性作用，筛选对细胞无毒的较大的浓度作为实验浓度。　　3、分别将原代培养的角质形成细胞和HaCat细胞分为两组，一组为对照组，另一组为神经酰胺2处理组。用real-timeRT-PCR方法在mRNA水平检测、对比两组细胞FLG，INV和LOR的表达水平;原代培养角质形成细胞，通过蛋白印迹法(Westernblotting)在蛋白水平检测以上三种分化蛋白的变化;用透射电镜观察两组原代角质形成细胞内板层小体的合成情况。　　四、统计学分析　　相应数据用SPSS17.0统计包进行分析，计量资料以均数±标准差（(x)±s）来表示，两样本均数比较用t检验，以p＜0.05有统计学意义。　　结果　　1、AD患儿急性皮损处三种分化蛋白的免疫组化染色强度比正常对照组显著减弱;应用图像分析系统进一步分析显示，AD组三种分化蛋白的平均光密度、积分光密度与对照组相比明显降低(P＜0.05)，阳性面积变化不明显(P＞0.05);　　2、应用CCK-8试剂盒检测，结果显示神经酰胺2对细胞的损伤有明显的浓度依赖性。2.5μmol/L未显示出明显的细胞毒性，本实验选取2μmol/L为实验浓度;　　3、给予原代培养的角质形成细胞及HaCat细胞神经酰胺22umol/L分别刺激24小时和48小时后，与对照组相比FLG，INV和LOR在mRNA水平表达升高(p＜0.05)，且48小时的表达量高于24小时;　　4、给予原代培养角质形成细胞神经酰胺22umol/L刺激48小时后，FLG，INV和LOR在蛋白水平表达升高(p＜0.05)，尤其FLG增高幅度明显;　　5、给予原代培养角质形成细胞神经酰胺22umol/L刺激48小时后，通过透射电镜观察，与对照组相比板层小体的数量明显增多(p＜0.05)。　　结论　　1、AD患儿急性期皮损处三种终末分化蛋白表达减少;　　2、神经酰胺2可在mRNA水平及蛋白水平促进三种终末分化蛋白的表达;　　3、神经酰胺2可促进角质形成细胞自身板层小体的合成;　　4、神经酰胺2可能通过促进角质形成细胞终末分化蛋白的表达及自身脂质的合成，而改善皮肤屏障功能。