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第一部分胆汁酸核受体FXR调控结直肠癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的机制研究目的:探讨胆汁酸核受体FXR对结直肠癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的调控作用及其机制。方法:选用人结肠癌细胞株Caco-2、HCT-116、HT-29,采用Western blot检测FXR及β-catenin的表达水平。siRNA沉默FXR后,采用双荧光素酶报告系统检测β-catenin转录活性的变化,采用Western blot检测β-catenin蛋白水平的表达变化。分别经不同浓度FXR激动剂GW4064(1、3、5umol/L)干预12、24、36和48h,采用噻唑兰试验(MTT)测细胞增殖能力的变化。GW4064干预后,采用凝胶迁移实验(EMSA)检测NF-κB的转录活性;采用双荧光素酶报告系统检测β-catenin的转录活性变化,采用EMSA检测β-catenin/TCF4复合物水平,Western blot检测GW4064干预后细胞核内β-catenin及总蛋白水平的变化,并采用qRT-PCR检测β-catenin mRNA水平的表达变化。在GW4064干预下,予以NF-κB信号通路的激动剂(LPS),重复上述实验检测对其影响。结果:(1)Caco-2、HT-29 高表达 FXR,HCT-116 表达程度较其低,FXR 同 β-catenin的表达在不同细胞系中不一致;(2)在HT-29、Caco-2、HCT-116细胞中沉默FXR可上调 Wnt 通路(HT-29 细胞:1.47 ± 0.14vs 1.04 ± 0.03,Caco-2 细胞:5.18 ± 0.41 vs3.63 ± 0.32,HCT-116 细胞:4.66 ± 0.43 vs3.22 ± 0.26,p<0.05),不影响 β-catenin蛋白表达;(3)GW4064干预HT-29、Caco-2、HCT-116细胞可显著抑制细胞增殖(HT-29 细胞 3uM 24h:0.48 ± 0.03 vs 0.74 ± 0.03,Caco-2 细胞 3uM 24h:0.31 ±0.01 vs 0.59 ± 0.05,HCT-116 细胞 5uM 24h:0.18 ± 0.01 vs 0.43 ± 0.04,p<0.05),其抑制作用随浓度的增加和作用时间逐渐增强;(4)在HT-29、Caco-2、HCT-116细胞中,GW4064促进NF-κB的转录活性;(5)在HT-29、Caco-2、HCT-116细胞中,GW4064能通过增加β-catenin/TCF4复合物,上调Wnt通路(HT-29细胞:1.14± 0.02 vs 0.87 ± 0.04,Caco-2 细胞:3.30 ± 0.14 vs 2.11 ± 0.10,HCT-116 细胞:2.89 ± 0.26 vs 1.28 ± 0.07,p<0.05),但不影响 β-cateninmRNA 和蛋白表达。(6)在HT-29、Caco-2、HCT-116细胞中,在LPS作用下,GW4064能通过增加β-catenin/TCF4 复合物,上调 Wnt 通路(HT-29 细胞:1.15 ± 0.03 vs 0.99 ± 0.03,Caco-2 细胞:5.24 ± 0.04 vs 3.91 ± 0.03,HCT-116 细胞:8.05 ± 0.22 vs 3.70 ± 0.05,p<0.05),与GW4064直接作用结果一致。结论:FXR缺失导致Wnt/β-catenin信号通路上调,促进肿瘤发生;FXR激动剂GW4064可显著抑制肿瘤细胞的增殖能力,但对Wnt/β-catenin信号通路具有上调作用。FXR与Wnt途径密切相关,不同FXR激活状态对Wnt通路的调控作用有所不同。第二部分益生菌在结肠炎相关结直肠癌小鼠模型中对胆汁酸核受体FXR的调节作用目的:在氧化偶氮甲烷(AOM)联合葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎(UC)癌变动物模型中,探讨益生菌干预后对胆汁酸核受体FXR及其下游通路的调控。方法:C57BL/6小鼠随机分为4组,第1-3组建立AOM/DSS诱导的UC癌变小鼠模型,腹腔注射AOM12.5mg/kg,1周后给予含2.5%DSS的饮用水,连续5天,之后换成普通饮用水,12周后建模完成。第1组为布拉氏酵母菌组,给予布拉氏酵母菌1.5g/kg/d每日灌胃;第2组为VSL#3组,给予VSL#3 1.5g/kg/d每日灌胃;第3组为模型对照组,不给予任何干预;第4组为空白对照组。12周后处死小鼠,统计瘤负荷(TL),进行病理学评估,采用qRT-PCR检测小鼠结肠组织Nr1h4、Fgf15mRNA的表达变化,采用免疫组化检测小鼠结肠组织FXR、SHP/NR0B2、FGF15的表达情况,采用ELISA检测小鼠血清FGF15分泌的情况。结果:(1)各组的瘤负荷显示:布拉氏酵母菌组(n=19,TL=0.20±0.07cm)、VSL#3组(n=20,TL=0.25±0.07cm)较模型对照组(n=19,TL=0.97±0.19cm)均显著下降,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)结肠上皮细胞Nr1h4、Fgf15mRNA表达量:模型对照组较空白对照组显著降低(n=6,Nr1h4 0.53 ±0.08 vs 1.10 ±0.09;Fgf50.80±0.16 vs 1.42 ±0.14),布拉氏酵母菌组(n=6,Nr1h4 1.29±0.15,Fgf15 1.87±0.26)、VSL#3 组(n=6,Nr1h4 1.31±0.21,Fgf15 2.16±0.34)较模型对照组升高,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)结肠上皮细胞免疫组化FXR表达量:模型对照组较空白对照组显著降低,布拉氏酵母菌组、VSL#3组较模型对照组升高;SHP、FGF15表达量,模型对照组较空白对照组显著降低,布拉氏酵母菌组、VSL#3组无明显变化。(4)小鼠血清FGF15 ELISA结果显示:模型对照组较空白对照组显著降低(n=6,0.51 ±0.33 vs 2.87±0.54),布拉氏酵母菌组(n=10,2.03 ±0.46)较模型对照组升高,差异有统计学意义(p<0.05),VSL#3组(n=10,0.58±0.21)无明显变化。结论:益生菌可以抑制AOM/DSS诱导的UC癌变小鼠的结肠成瘤,其机制可能与益生菌上调FXR-FGF15轴有关。