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以健脾为主的中药复方胃肠安(WCA)是上海市名中医、龙华医院肿瘤科邱佳信教授的临床验方,在改善胃癌患者脾虚证、延长生存期、降低根治术后复发转移、减轻化疗不良反应等方面具有确切的临床疗效。实验研究表明基于胃癌“脾虚”病机的复方胃肠安具有明确的抗致突变作用,能在胃癌的起始和启动阶段起到阻断作用;抑制人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的生长和原位移植瘤的转移;抑制胃癌细胞的增殖;诱导胃癌细胞的凋亡;抑制胃癌细胞的侵袭和转移及上皮间质转化;调节免疫等作用。目的:从中药复方研究的整体角度出发,采用网络药理学方法研究复方胃肠安的核心化学成分,作用靶点及信号通路;蛋白质组学技术分析复方胃肠安作用人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型后差异蛋白的变化;采用网络药理学与蛋白质组学联合分析,筛选网络中复方胃肠安共同作用的潜在靶点及信号通路;同时研究复方胃肠安中重要活性化合物木犀草素抗胃癌的潜在作用机制。方法:1.运用网络药理学研究方法,构建化合物-靶标、靶标-疾病及靶标-通路等多水平多层次的网络,利用Cytoscape软件,构建HIPPIE(Human Interated ProteinProtein Interaction r Eference,HIPPIE)蛋白交互网络,对复方胃肠安采用基因本体(Gene Ontology,GO),KEGG信号通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG),疾病本体(Disease Ontology,DO),医学主题词(Medical Subject Headings,Me SH)的富集分析。根据网络药理学方法获得的活性化合物,核心靶标构建复方胃肠安的靶标网络,采用Cytoscape3.6.0软件计算网络拓扑参数,介数中心性(Betweenness Centrality,BC),中心接近度(Closeness Centrality,CC),拓扑系数(Topological Coefficient,TC),节点度(Degree,DE),筛选复方胃肠安网络药理学中的核心靶点。2.构建人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型,采用蛋白质组学技术探究复方胃肠安作用人胃癌裸小鼠皮下移植瘤后,与生理盐水对照组比,鉴定差异的上调及下调蛋白,并对差异蛋白进行基因本体GO分析,信号通路KEGG的富集分析。根据蛋白质组学筛选的差异蛋白,将蛋白质组学中的差异上下调蛋白检索公共数据库,构建蛋白质相互作用(PPI)网络,采用Cytoscape3.6.0软件的Cluster One算法对PPI网络进行核心蛋白聚类分析,按照P<0.0001、Node>6、ND(network density)>0.05筛选标准,筛选复方胃肠安蛋白质组学网络中的核心蛋白。3.对复方胃肠安作用后的网络药理学网络和蛋白质组学网络进行联合分析,构建两者共同作用网络,找到网络药理学与蛋白质组学共同重合的靶点。构建人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型,Q-PCR和Western-blot的方法,验证上述的潜在靶点的表达水平。4.采用CCK8(Cell Counting Kit-8)、流式细胞术、Hoechst染色、Western-Blot等技术探究复方胃肠安中重要活性成分木犀草素对胃癌细胞的增殖及凋亡的影响。结果:1.网络药理学分析得到复方胃肠安的136个活性化合物,306个核心靶标,151个胃癌相关靶标。通过生物信息学基因本体GO分析,结果在分子功能(Molecular Function,MF)水平与复方胃肠安显著关联的GO术语有117个,与胃癌有显著关联的GO术语有72个。在生物过程(Biological Process,BP)水平与复方胃肠安显著相关的GO术语有1578个,与胃癌有显著关联的GO术语有1104个。在细胞组件(Cellular Component,CC)水平,与复方胃肠安有显著关联的GO术语有71个,与胃癌有显著相关的GO术语有54个。通过KEGG信号通路富集分析,复方胃肠安靶标与胃癌共关联的信号通路共有8条,包括HIF-1 signaling pathway、Endocrine resistance、EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance、ERBB signaling pathway、FOXO signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、Thyroid hormone signaling pathway、RAP1 signaling pathway。采用网络分析,在网络药理学的网络中筛选出8个潜在的作用靶点,分别为PTGS2、Bax、Cycs、RELA、ABCC1、HIF1A、TOP1、GSTP1。2.通过蛋白质学技术分析复方胃肠安作用于人胃癌裸小鼠皮下移植瘤后,与生理盐水模型组相比,共鉴定出3385个差异蛋白,其中有2856个蛋白具有定量信息。其中417个蛋白表达上调,大于1.2倍,340个蛋白表达下调,小于0.83倍。通过生物信息学基因本体GO分析,结果显示在分子功能(MF)水平,与复方胃肠安显著相关的GO术语有542个。在生物过程(BP)水平与胃肠安显著相关的GO术语有1940个。在细胞组件(CC)水平与胃肠安显著相关的GO术语有1251个。通过KEGG信号通路富集分析,结果显示,与复方胃肠安的显著相关的信号通路共45条,涉及多条肿瘤相关通路。在构建的蛋白质网络中,共筛选出20个核心蛋白聚类(cluster)。3.对网络药理学的核心靶标,活性化合物,与蛋白质组学筛选的差异蛋白进行联合分析,显示复方胃肠安在网络药理学与蛋白质学共同富集在8条信号通路,分别是TNF Signaling Pathway、IL-17 Signaling Pathway、PI3K-Akt Signaling Pathway、Renin-angiotensin system、Focal adhesion、TNF Signaling Pathway、NF-kappaa B Signaling Pathway、Glycolysis/Glucone Genesis。对复方胃肠安的网络药理学和蛋白质组学网络进行联合分析,网络药理学网络中的8个核心靶标和蛋白质组学网络中20个核心蛋白聚类(cluster)的重叠分析中,ABCC1、PTGS2、Cycs、Bax四个蛋白为两者共同重叠的蛋白。Q-PCR和Western Blot验证结果表明,与对照组相比,复方胃肠安在人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型中,能下调ABCC1和PTGS2蛋白的表达,上调Bax和Cycs蛋白的表达。4.通过实验验证,复方胃肠安重要活性化合物木犀草素干预胃癌细胞后,呈时间-剂量依赖性抑制胃癌细胞增殖,同时将细胞周期阻滞在S期,诱导胃癌细胞凋亡的发生,降低线粒体膜电位,增加Bax,Caspase3,Cycs的表达,降低Bcl-2的表达,下调p-Akt的表达;木犀草素组加入PI3K-Akt通路抑制剂LY294002后,与木犀草素组相比,Bax、Caspase3、Cycs蛋白的表达增加,Bcl-2蛋白表达降低,p-Akt蛋白的表达降低。结论:1.复方胃肠安通过多靶点、多途径发挥抗胃癌作用。其作用机制可能涉及8条信号通路和ABCC1、PTGS2、Cycs、Bax4个核心靶标。2.复方胃肠安抗胃癌机制涉及上调Cycs、Bax的表达,下调ABCC1、PTGS2的表达。3.复方胃肠安中重要活性化合物木犀草素可抑制胃癌细胞增殖,阻滞细胞周期在S期;诱导胃癌细胞凋亡,其诱导凋亡机制与上调Bax的蛋白表达,下调Bcl-2的蛋白表达有关,并可能涉及PI3K-Akt信号通路。