牙鲆是我国重要的海水养殖种类之一。近年来,病毒性疾病特别是淋巴囊肿病的爆发给养殖户带来了严重的经济损失,导致牙鲆养殖问题频发,产量下降。生物技术的发展,推动了现代种业的发展,也成为良种选育的新手段。选择性剪接是与剪接一起发现的,并使一个基因产生多个m RNA亚型,并编码具有不同功能的蛋白质,增加了蛋白质组的多样性,但是正常剪接模式的中断会导致基因功能障碍甚至疾病。三重基序（TRIM）和TRIM样蛋白是一个高度保守的蛋白家族,它们的特征是具有保守的RING-BBox-coiled-coil（RBCC）基序,另外还有一个或多个独特的C端结构域。TRIM蛋白在转录、信号转导、细胞命运等多种细胞过程中发挥调控作用。许多人类TRIM蛋白可被干扰素或病毒感染诱导表达,可以发挥抗病毒功能。TRIM蛋白至少有三种主要的抗病毒机制被报道。本研究筛选出两个与抗病紧密相关的基因thbs2和trim25,以牙鲆为研究对象,利用分子生物学方法对牙鲆thbs2和trim25基因进行分子鉴定,并重点研究了trim25抗病机制。具体研究内容如下:1.牙鲆thbs2和trim25鉴定及表达分析根据牙鲆头肾转录组数据发现thbs2和trim25同源序列,并采用RACE法扩增其全长。本研究发现牙鲆trim25有四个可变剪接体分别为trim25 X1、trim25X2、trim25 X3、trim25 X4。利用生物信息网站与软件分析了核苷酸和氨基酸序列、预测蛋白结构域及构建系统进化树,最后使用荧光定量PCR技术分析他们在不同胚胎发育时期中m RNA相对表达量。结果显示thbs2基因c DNA全长4313bp,其中5’UTR长度210bp,3’UTR长度575bp,有10个保守结构域,与大黄鱼和尖吻鲈的关系最近,在心跳期和出膜期表达显著升高。trim25四个可变剪接体氨基酸序列同源性为95.49%;均有RING、BBox、PRY/SPRY结构域;trim25 X1和trim25 X2形成了一个独立的分支,然后与trim25X3和trim25 X4聚在一起,它们与尖吻鲈和尼罗罗非鱼trim25最相似;四个可变剪接体在胚胎发育前期的表达量均比发育后期表达量高。2.牙鲆thbs2和trim25亚细胞定位及抗淋巴囊肿相关性分析为进一步了解牙鲆thbs2和trim25与淋巴囊肿病的相关性及细胞定位情况,通过无缝克隆的方法构建了p EGFP-thbs2和四个可变剪接体的真核表达载体p EGFP-trim25 X1/X2/X3/X4;通过细胞转染及亚细胞定位观察基因真核表达情况;收集牙鲆淋巴囊肿抗病与患病组织,利用荧光定量PCR技术检测基因的相对表达量。最后成功构建了thbs2和trim25四个可变剪接体真核表达载体,并观察到Thbs2分布在整个细胞质中,Trim25 X1/X2/X3点状分布在细胞质中,Trim25 X5分布在整个细胞质和细胞核中。thbs2在抗病头肾、肝脏、血液、鳃和心脏中表达量显著高于患病组,在肌肉中,差异为极显著;trim25 X1在抗病组织中表达量更高而trim25 X2/X3/X4在患病的鳃、肌肉和心脏中表达量更高。这些数据表明thbs2和trim25在牙鲆抗病与患病组织中表达存在差异,具有抗淋巴囊肿病相关性。3.牙鲆trim25在先天免疫应答中的功能探究为进一步了解四个可变剪接体在先天免疫应答中的作用,是否存在功能差异及其作用机制,利用poly I:C刺激细胞并进行活体注射,收集样品检测m RNA和蛋白水平的表达量;并选取5个免疫相关基因在所收集的样品中检测m RNA的相对表达量。结果显示,四个可变剪切体在poly I:C刺激的细胞中均表达上调,但trim25 X1/X3在5个时间点表达量并没有呈现出上升或下降的趋势,而X2和X4在60 h时表现出升高趋势;WB结果显示,trim25 X2在poly I:C刺激细胞12h时,对照组表达量较高,但24-60 h处理组表达量均明显增加;免疫相关基因在牙鲆淋巴囊肿抗病与患病组织中表现出不同的表达模式,并在poly I:C刺激的细胞和组织样品中表达存在差异。这些相关基因都位于RIG-I信号通路上,而trim25位于信号通路上游,可能通过这一信号通路调控免疫相关基因并产生抗病毒免疫反应。