论文部分内容阅读
研究背景和目的:肺癌在我国发病率很高,肺癌中非小细胞（non-small cell lung cancer,NSCLC）占80%左右,而肺腺癌又是非小细胞肺癌中最常见的类型。目前关于肺癌主要的治疗措施包括手术、放射治疗、化学治疗及生物治疗等,手术治疗具有一定的局限性,而放射治疗和化学治疗尽管降低了肺癌患者的死亡率,但治疗效果并不十分理想。肿瘤细胞的异常增殖是肿瘤发生发展的重要原因,而多数肿瘤细胞是通过凋亡逃逸而获得了无限增殖的能力。因此,从诱导细胞凋亡传导的通路出发,寻找安全有效的靶向性调控肿瘤细胞凋亡的药物一直是从事肿瘤研究工作者们研究的热点。近年来中医中药对肿瘤的影响受到国内外学者的广泛关注。美洲大蠊不但在祖国医学中有重要的药用价值,而且越来越多的研究显示其对多种人肿瘤细胞生长有抑制作用。尽管已有研究证实,美洲大蠊提取物可抑制肺癌H125细胞生长并诱导细胞周期阻滞和凋亡,但其具有的调控机制尚不明确,美洲大蠊提取物抗肺癌的实验依据还不充分。细胞内外环境的信息交换和传导离不开细胞信号通路的作用,而信号转导的异常又是导致包括肿瘤在内的多种疾病发生的重要原因。PI3K/AKT信号通路是影响细胞各种生物学行为的重要通路之一,可通过调控下游相关基因的表达水平,影响细胞增殖、周期、侵袭和凋亡等生物学过程,在包括肺癌在内的多种肿瘤细胞的发生发展过程中发挥着重要作用。已有研究证实美洲大蠊提取物可通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥促进卵巢癌细胞和肝星状细胞凋亡的作用,但其是否通过该机制诱导肺癌细胞凋亡并不清楚。本实验通过体外观察美洲大蠊提取物诱导的肺腺癌A549细胞凋亡及其对PI3K/AKT信号通路的影响,探讨美洲大蠊提取物抗肺癌的分子机制,以期为美洲大蠊提取物抗肺癌的临床应用提供新的理论依据。方法:1.以0、12.5、25、50、100和200μg/ml不同浓度的美洲大蠊提取物作用于体外培养的肺腺癌A549细胞24、48和72h后,采用MTT法检测肺腺癌A549细胞增殖抑制率,并计算出不同作用时间下美洲大蠊提取物对肺腺癌A549细胞的IC50;在后期实验中以50、100和200μg/ml浓度的美洲大蠊提取物作用A549细胞48h后,2.流式细胞仪检测细胞周期变化;3.采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;4.流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化;5.采用半定量RT-PCR检测PI3K/AKT信号通路相关基因PI3K、AKT和凋亡相关基因p53、Caspase-3和CytC mRNA的表达;6.采用Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关基因PI3K、AKT和凋亡相关基因p53、Caspase-3和CytC蛋白的表达。结果:1.以12.5、25、50、100和200μg/ml美洲大蠊提取物分别处理24、48和72h后,A549细胞的IC50分别为249.20μg/ml、135.90μg/ml和95.87μg/ml。美洲大蠊提取物处理组细胞的增殖抑制率显著高于对照组（0μg/ml）,且呈浓度-时间依赖性（P<0.05）。2.中（M）浓度100μg/ml和高（H）浓度200μg/ml的美洲大蠊提取物处理组中A549细胞在G0/G1期[（59.83±1.02）%、（56.56±1.10）%]和S期[（17.96±0.78）%、（15.35±0.54）%]所占百分比较对照组[（62.20±1.12）%、（24.75±1.02）%]相比均显著降低,而在G2/M期[（22.18±1.06）%、（27.85±1.22）%]所占百分比较对照组（13.05±0.36）%显著升高（P<0.05）。3.以50（低浓度,L）、100和200μg/ml美洲大蠊提取物处理48h后,A549细胞凋亡率分别为（9.26±0.25）%、（15.48±1.38）%和（20.85±1.46）%,与对照组（3.38±1.06）%相比,均显著升高,且呈浓度依赖性（P<0.05）。4.以50、100和200μg/ml美洲大蠊提取物处理48h后,A549细胞绿色荧光百分比分别为（15.06±0.75）%、（20.59±1.18）%、（26.25±1.26）%,与对照组（1.23±0.25）%相比,均显著升高,且呈浓度依赖性（P<0.05）。5.50、100和200μg/ml美洲大蠊提取物可呈浓度依赖性上调p53（1.67±0.15、2.43±0.18和4.16±0.35,对照组为0.96±0.08）、Caspase-3（1.78±0.53、2.51±0.16和3.86±0.25,对照组为0.98±0.05）、CytC（1.51±0.12、2.16±0.12和3.75±0.26,对照组为0.95±0.06）及下调PI3K（0.84±0.06、0.72±0.05和0.35±0.03,对照组为1.00±0.06）、AKT（0.65±0.03、0.42±0.03和0.33±0.02,对照组为1.02±0.06）mRNA的表达。6.50、100和200μg/ml美洲大蠊提取物可呈浓度依赖性上调p53（0.28±0.02、0.44±0.03和0.54±0.04,对照组为0.09±0.02）、Caspase-3（0.33±0.02、0.40±0.03和0.49±0.03,对照组为0.12±0.02）、CytC（0.25±0.03、0.37±0.04和0.52±0.05,对照组为0.06±0.01）及下调PI3K（0.57±0.04、0.43±0.04和0.11±0.02,对照组为0.66±0.04）、p-AKT（0.40±0.02、0.34±0.03和0.11±0.03,对照组为0.46±0.03）蛋白的表达。结论:1.美洲大蠊提取物可抑制肺腺癌A549细胞增殖,将细胞周期阻滞于G2/M期,并诱导细胞凋亡;2.美洲大蠊提取物可通过p53介导的线粒体途径诱导肺腺癌A549细胞凋亡;3.美洲大蠊提取物可通过抑制PI3K/AKT信号通路上调p53表达进而诱导肺腺癌A549细胞凋亡。