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雄性生殖干细胞(male germ stem cells, mGSCs)是性腺分化后一直存在于睾丸曲细精管中、唯一能将遗传物质传递给后代的干细胞。在mGSCs的细胞学特性、分离纯化方法、体外长期培养系统的探索、体外诱导mGSCs形成单倍体细胞和精子、mGSCs的基因修饰和同种异种间的移植等方面,许多研究者做了大量的探索性工作,新的成就不断涌现,但是关于mGSCs的研究,仍然处于起步阶段。本试验在前人研究的基础上,以新生牛睾丸为材料,进一步探讨mGSCs分离纯化的方法及效果;在不同培养体系中,观察体外培养新生牛mGSCs的特性,定向诱导新生牛mGSCs体外形成精子样细胞;克隆人c-Myc基因并构建真核表达载体,与SV40、hTERT表达载体转染mGSCs,探讨mGSCs长期存活和增殖并进一步获得永生,探讨mGSCs体外诱导单倍体可行性。牛mGSCs的分离采用两部酶消化法,即先用0.1%胶原酶Ⅳ3 7℃消化20min,然后以0.25%胰酶37℃消化曲细精管10min,有利于分离mGSCs并利于mGSCs存活。差速贴壁法和Percoll密度梯度离心可以对新生牛mGSCs进行纯化,其中三次差速贴壁法可获得较Percoll密度梯度离心活力强和纯度高的mGSCs。生精细胞悬液中有两类球形细胞,大小不等。较小的细胞胞质较暗,在接种1h后开始贴壁,3h后有突起产生,8～10h伸出伪足。较大的细胞核质比高,5h呈悬浮状态,18～20h完全贴壁,细胞为圆形或椭圆形,大小一致,核质比高。2d后mGSCs数量开始增加,出现两个、四个聚集在一起的小细胞团,5d左右形成小集落,AKP染色阳性。探索了血清浓度、支持细胞和mGSCs接种密度以及干细胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对新生牛生殖系干细胞体外增殖的影响,并对其进行了鉴定。试验1:以高糖DMEM为基础培养液,添加浓度为0%、2.5%、5%和10%的胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS),分为4个试验组。结果表明,血清浓度影响新生牛mGSCs的体外增殖,添加2.5%的FBS比较合适。试验2:分别以六种密度支持细胞作为饲养层,其中以1.0×106/mL接种对新生牛mGSCs增殖效果最好,与其试验组差异显著(P<0.05)。试验3:将精原细胞以1.0×104/mL、5.0×104/mL、1.0×105/mL、2.0×105/mL四种密度接种于饲养层上,结果2.0×105/mL组克隆形成最早,相对克隆形成率最高(P<0.05)。试验4:培养液中加入不同浓度的SCF、LIF及GDNF,可增加新生牛mGSCs的数量,其中加入20μg/L SCF、80μg/L GDNF、10μg/L LIF后,与对照组比较能显著提高新生牛mGSCs数(P<0.05)。采用碱性磷酸酶染色、细胞免疫组织化学染色和RT-PCR对新生牛mGSCs进行鉴定,结果碱性磷酸酶染色呈弱阳性;细胞免疫组织化学染色Integrinβ1阳性、c-kit阳性;经RT-PCR扩增,获得了120 bp的Gfrα1序列和280bp的c-kit序列,与预期的扩增产物大小一致。因此,培养液中添加2.5%FBS、20μg/LSCF、80ng/mL GDNF、10μg/L LIF ,支持细胞和新生牛mGSCs分别以2.0×105/mL接种比较适宜对新生牛mGSCs的增殖有利。经PCR扩增获得了3.6 kb的c-Myc片段,克隆的片段包含有第2、第3外显子的序列,编码一个439个氨基酸的蛋白质。将c-Myc、hTERT连接到p-EGFP载体上,成功构建p-EMY和p-ETE载体。用pCI- neo-hTERT+pSV3-neo、pEMY+ pCI- neo-hTERT、pCI- neo-hTERT、pEMY转染mGSCs获得四个假定细胞系GTS1、GMT5、GT3、GM7,分别传至35代、28代、29代、28代。pCI- neo-hTERT+pSV3-neo、pEMY+ pCI- neo-hTERT联合转染效率高于单个载体转染。所获得的GTS1、GMT5、GT3、GM7假定细胞系均表达GFR -1,Oct-4,c-kit和Integrinβ1。应用RA诱导、成年牛睾丸组织液诱导以及低温诱导获得精子样细胞。应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞,单被体细胞比例为19.3%。诱导精子样细胞能激活卵母细胞,囊胚发育率20.36%。