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苹果炭疽菌叶枯病(Glomerella leaf spot,GLS)是近年来高发的流行性真菌性病害,主要危害苹果叶片,引起叶片的干枯、脱落,偶尔也能侵染果实,产生坏死性斑点,不仅造成当季果实质量和产量的下降,而且还削弱了树势,影响来年开花结果,给我国苹果产业带来了严重的危害。目前对于炭疽叶枯病的防治多以化学药剂防治为主,但是同时也带来不可忽视的环境污染、成本增加的问题。所以了解苹果抗炭疽菌叶枯病的抗性机理,挖掘抗性相关基因,进一步培育和种植抗病性强的优良品种是解决该病最根本、有效、安全的措施。 利用实时荧光定量PCR检测相关的抗病基因的表达量是较为准确易行的手段之一。近年来,实时荧光定量 PCR技术应用于生命科学的很多领域,在基因表达量的研究中发挥重要作用。选取合适的内参基因进行试验校正是进行基因表达量分析可靠性的重要保证,因此筛选出合适的内参基因对后续基因表达量分析具有重要的意义。 许多研究表明,植物在抵御病原菌侵染过程中超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶等的防御相关酶被诱导,并在植物防卫过程中发挥着重要作用。而植物抗病基因(R基因)是当下研究热点,关于苹果炭疽叶枯病的相关抗病基因目前鲜有报道,因此筛选出炭疽叶枯病的相关抗病基因(R基因)对研究炭疽叶枯病的发病机理有着重要的意义。 1、利用实时荧光定量技术和geNorm,NormFinder和 Bestkeeper三种软件,对接种病菌后的试验材料的内参基因的稳定性进行分析,其结果表明:GAPDH和UBQ可以作为最佳内参基因组合用于后续试验,这两个基因在不同时间段的接种叶片内表达量相对稳定。 2、以‘富士’和‘嘎啦’为试验材料,对接种炭疽叶枯病病菌后的叶片进行酶活性测定分析。结果表明,在接种病原菌后,两个品种的SOD、POD、CAT、PPO活性均有所升高,在0h至72h时间段内,总趋势为先升高后下降,在抗病品种‘富士’中的活性普遍高于感病品种‘嘎啦’。 3、利用实时荧光定量技术分析SOD、POD、PPO、CAT酶对应的基因的表达,其结果表明:相关酶对应的基因的表达量存在差异,且POD、CAT变化趋势与酶活性趋势相似,抗病品种中的表达量普遍高于感病品种。 4、在前期对抗炭疽菌叶枯病基因精细定位的试验基础上,在定位区域内筛选出与抗病相关的20个基因,利用实时荧光定量技术分析接种病原菌后20个基因的表达量,其结果表明,7个候选基因(MDP0000664885、MDP0000877582、MDP0000318360、MDP0000201429、MDP0000255274、MDP0000272940、MDP0000481973)均响应病原菌的诱导,参与抗病相关的防御反应。