目的:乳腺癌是危害全球女性健康的第一杀手,化疗在乳腺癌的治疗过程中占有重要地位。但是,多药耐药（Multi Drug Resistance,MDR）的出现导致化疗的失败,极大地限制了局部晚期和转移性乳腺癌的治疗效果。药物转运蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）能够将细胞内的化疗药物排出细胞外,其过量表达是MDR产生的主要原因之一。尽管在MDR细胞中关于P-gp的表达调控已被深入研究,但是目前对P-gp活性调控的研究还很少。Rack1（Receptor for Activated C Kinase 1）是细胞内的一种支架蛋白,介导不同蛋白质之间的相互作用,在肿瘤细胞抵抗化疗药物的过程中发挥重要作用。前期研究发现Rack1是P-gp的一个结合蛋白质,但是Rack1是否调控P-gp的转运活性,目前尚未可知。本研究中,我们利用多药耐药的乳腺癌细胞系,通过一系列体外细胞学实验,结合构建体内耐药移植瘤模型,明确耐药细胞中Rack1对P-gp转运泵活性的调控作用,并进一步探究Rack1调控P-gp活性的分子机制,为改善临床晚期耐药乳腺癌的治疗以及寻找新的治疗靶点提供线索。方法:1.采用特异性的小干扰RNA下调耐药细胞系中Rack1的表达,Western Blotting检测Rack1的敲减效果以及P-gp蛋白水平的变化。2.通过CCK-8的方法,分析MDR乳腺癌细胞系中降表达Rack1后对化疗药物表柔比星的敏感性变化,并通过软件计算相应的IC₅₀值。3.将P-gp的荧光底物罗丹明123（Rhodamine,Rh123）加入细胞,孵育一段时间后,采用流式细胞技术检测下调Rack1前后细胞内Rh123的强度变化,分析P-gp转运活性的变化。4.利用化疗药物表柔比星的荧光特性,将其加入细胞孵育一段时间后,采用荧光显微镜观察细胞内表柔比星的荧光强度,分析敲减Rack1前后MDR乳腺癌细胞内表柔比星的蓄积情况。5.采用小干扰RNA技术,下调MDR乳腺癌细胞中Src的表达,免疫印迹法分析细胞内Src和P-gp的蛋白水平变化。6.在敲减Src表达后的MDR乳腺癌细胞系中,分别采用CCK-8的方法检测细胞对表柔比星的敏感性,采用流式细胞分析技术检测P-gp的转运活性,采用免疫荧光的方法分析细胞内表柔比星的蓄积情况。7.采用Src激酶家族特异性的抑制剂Saracatinib和Dasatinib,抑制Src的激酶活性,Western Blotting分析total-Src、phosphor-Src以及P-gp的蛋白水平变化。8.在MDR乳腺癌细胞系中抑制Src激酶活性后,分别采用CCK-8的方法分析细胞对化疗药物敏感性的变化,采用流式细胞技术分析细胞内Rh123的荧光强度及P-gp转运活性的变化,采用免疫荧光技术分析化疗药物在细胞内的蓄积情况。9.采用小干扰技术敲减细胞内Rack1的表达,免疫共沉淀分析P-gp/Src/Cav1（Caveolin-1）之间的相互作用;敲减细胞内Src的表达,免疫共沉淀分析P-gp/Rack1/Cav1之间的相互作用。10.构建表达针对Rack1非编码区序列的shRNA的慢病毒,构建稳定敲减Rack1的MDR乳腺癌细胞系。构建携带Flag标签的野生型Rack1^WT和失去Src结合能力的Rack1^Y246F突变体（将第246位的Y突变为F）表达质粒;在敲减Rack1的细胞中重新表达Rack1^WT和Rack1^Y246F,免疫共沉淀分析P-gp/Src/Cav1之间的相互作用。11.Western Blotting分析敲减Rack1和Src的表达或者抑制Src的激酶活性后对phosphor-Src和phosphor-Cav1的表达变化情况。12.在稳定敲减Rack1的细胞中,分别采用Rack1^WT和Rack1^Y246F进行拯救,然后采用免疫印迹分析Rack1、total-Cav1、phosphor-Cav1的表达变化情况。13.构建野生型的Cav1(Cav1^WT)和模拟磷酸化持续激活的Cav1^Y14E突变体表达质粒,在敲减Cav1的细胞中重新表达Cav1^WT和Cav1^Y14E,免疫共沉淀分析其与P-gp的结合能力;两种拯救的细胞中,分别加入Src激酶抑制剂,利用流式细胞技术分析P-gp的转运活性。14.在重新表达Rack1^WT和Rack1^Y246F后,采用CCK-8的方法检测细胞对表柔比星敏感性的变化,采用流式细胞分析技术检测细胞内荧光强度的变化,分析P-gp转运活性的变化。15.将Rack1敲减组及其对照组细胞,Rack1^WT-和Rack1^Y246F-拯救组及其对照组细胞,接种至裸鼠皮下构建移植瘤,然后采用表柔比星治疗,分析不同组之间的肿瘤体积差异。结果:1.敲减MDR乳腺癌细胞系中Rack1的表达后,P-gp的蛋白水平没有显著变化。2.下调MDR乳腺癌细胞中Rack1的表达后,细胞对表柔比星的敏感性增加,IC₅₀值降低。3.敲减耐药细胞中Rack1的表达后,Rh123荧光分子阳性细胞的比例增加,说明P-gp的外排能力减弱。4.敲减耐药细胞中Rack1的表达后,免疫荧光发现表柔比星在细胞中的蓄积量增加。5.在MDR乳腺癌细胞系中下调Src的表达,P-gp的蛋白表达水平不受影响。6.敲减耐药细胞Src的表达后,细胞对表柔比星的敏感性增加,IC₅₀值降低;流式细胞技术检测Rh123荧光分子阳性细胞的比例增加,P-gp将Rh123转运到细胞外的能力下降;免疫荧光显示,表柔比星在细胞内的荧光强度增加。7.Saracatinib和Dasatinib两种抑制剂均能以剂量-依赖性地抑制Src的激酶活性,但不影响Src的表达,也不影响P-gp的表达水平。8.抑制Src的激酶活性后,耐药细胞对表柔比星的敏感性增加,IC₅₀值下降;Rh123荧光分子在细胞内的蓄积量增加;免疫荧光发现细胞内表柔比星的荧光强度增加,表明P-gp的转运活性下降。9.下调乳腺癌耐药细胞中Rack1的表达后,P-gp和Src的蛋白水平没有显著变化,但二者的结合能力下降,同时,P-gp与Cav1的相互作用增加;下调Src的表达后,P-gp与Rack1的相互作用不受影响,P-gp与Cav1的结合能力增加。10.成功建立了Rack1稳定敲减的细胞系;在该细胞中外源性导入Rack1^WT和Rack1^Y246F突变体后,使得Rack1的表达水平恢复至接近内源性Rack1的水平;在Rack1敲减的细胞中,重新表达Rack1^WT,恢复了P-gp和Src之间的相互作用,并抑制了P-gp与Cav1的结合;而重新表达Rack1^Y246F突变体,不能够拯救P-gp和Src之间的相互作用,而且P-gp与Cav1之间仍有较强的相互作用。11.敲减耐药细胞中Rack1和Src的表达,或者抑制Src的激酶活性,均能抑制Cav1的磷酸化,对Cav1的本底表达水平没有影响。12.在稳定敲减Rack1表达的耐药细胞中,Cav1的磷酸化受到抑制,重新表达Rack1^WT,可恢复细胞中Cav1的磷酸化,而Rack1^Y246F突变体拯救组细胞,Cav1的磷酸化仍然受到抑制。13.有效地敲减耐药细胞中内源性Cav1的表达,外源性的Cav1^WT和Cav1^Y14E突变体在该细胞中的表达水平接近内源性水平;相比于Cav1^WT,Cav1^Y14E突变体与P-gp的结合能力减弱;流式细胞结果分析敲减Cav1的表达,增强了P-gp的转运能力;与Cav1^WT相比,重新表达Cav1^Y14E突变体可促进Rh123的外排,P-gp的转运能力增加;此外,Cav1^WT拯救组细胞中使用Src抑制剂后会显著抑制P-gp的转运活性,而突变体拯救组细胞中使用Src抑制剂后对P-gp转运活性的抑制效果不明显。14.与Rack1^Y246F相比,Rack1^WT拯救的细胞能够恢复对表柔比星的抵抗,IC₅₀值增加,P-gp转运Rh123的能力增加,Rh123阳性细胞所占比例增加。15.在体内裸鼠耐药细胞移植瘤模型中,稳定敲减Rack1组和Rack1^Y246F拯救组小鼠接受表柔比星处理后,肿瘤体积明显缩小;而Rack1^WT拯救组小鼠肿瘤对表柔比星的治疗产生抵抗。结论:本次研究证明,乳腺癌耐药细胞中Rack1和Src的表达正调控P-gp转运活性,促进肿瘤细胞对化疗药物抵抗。Rack1作为支架蛋白,介导了Src和P-gp之间的相互作用。在此相互作用复合体中Src磷酸化Cav1,后者由非磷酸化状态到磷酸化状态的转变,导致其与P-gp的相互作用下降,P-gp的转运活性从抑制状态变为激活状态。敲减Rack1或者破坏Rack1/Src/P-gp之间的相互作用可抑制P-gp的转运泵活性,P-gp将化疗药物泵出细胞外的能力下降,细胞内药物蓄积增加,对药物的敏感性增加,耐药能力减弱。综上所述,Rack1可作为新的潜在的治疗靶点用于开发抗肿瘤药物,逆转肿瘤细胞多药耐药。