研究背景目前为止,在全球所有的癌症中,肺癌是一种常见的癌症类型,占据了近10%的比例。据估计,每年全世界新增近160万例肺癌病例。临床上,大部分肺癌患者的发现时都已处于晚期,且不到15%的患者可以手术治疗,而术后的五年生存率也只有15%[1]。因此肺癌已经成为世界上致死人数最多的恶性肿瘤之一,是人类健康的重大威胁[2]。其中小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)占总肺癌病例的13%至20%左右。吸烟是导致SCLC发生的主要原因之一。虽然SCLC在初期阶段对化疗较为敏感,但容易发生多药耐药(multi-drug resistance,MDR)现象,造成化疗失败,肿瘤易发生复发和转移,预后较差,5年的生存率只有15%左右。多药耐药(多重耐药)是指已经接触过抗肿瘤药物的肿瘤对于无论在功能或者结构都不相关的多种药物具有耐药性[31。大多数研究表明肿瘤多药耐药产生机制多种多样,较为复杂,主要有癌细胞躲避了药物引发的细胞凋亡过程、耐药蛋白外排、细胞凋亡敏感度降低、细胞存活信号增强等造成的[4]。但SCLC耐药性产生的机制尚不明确。因此,阐明SCLC产生耐药性的机制成为近些年亟需解决的问题。微小RNA(micro RNAs,miRNA)是一类大约有22个核苷酸的单链非编码RNA。miRNA可以通过参与基因的转录后调节,从而影响细胞增殖、分化、凋亡等过程。miRNA的突变和失调已被证实与多种人类疾病密切相关,包括肿瘤耐药。近年来的研究表明,miRNA已成为一种应用于癌症诊断、预后、治疗的重要生物标记物[5]。例如,在某些卵巢癌中TUBB3异常高表达,TUBB3是miR-200c的靶基因,细胞中过表达miR-200c可以引起TUBB3表达量下降,从而提高细胞对抗肿瘤药物紫杉醇的敏感性[6,7]。miR-34a和miR-126则可以使耐药型非小细胞肺癌A549/DPP对抗肿瘤药物DPP的耐药性下降[8,9]。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,LncRNA)是一类大于200个核苷酸的非编码RNA。LncRNA主要影响基因转录调节、转录后调节和表观遗传调节。除此以外,许多相关研究也表明LncRNA在某些疾病状态下异常表达。如在前列腺肿瘤中,LncRNAPCGEM1参与调控肿瘤细胞的生长和增殖[10];在肝癌和肺癌中,LncRNAMALAT-1(也可以称为NEAT-2)的表达量异常升高,其参与调控肝癌和肺癌细胞的增殖[11,12];Ying等人发现上调MALAT-1可以促进膀胱癌的转移[13]。除了癌症以外,LncRNA在其他疾病也存在异常的表达状态,如有研究发现PRINS的高表达容易使人罹患银屑病[14]。Wang KC等在HOXA基因上发现了定位于染色体7p15.2的5’端的LncRNA,该LncRNA被称为“HOXA远端转录本,,(HOXA transcript at the distal tip,HOTTIP)[15]。研究发现 HOTTIP 在肝癌和食管鳞状细胞癌中异常表达,影响信号通路,进而影响疾病发生、发展和预后[16]。课题组前期通过Arraystar公司的LncRNA的芯片,对人小细胞肺癌细胞株(H69)及其耐药细胞株(H69AR)的LncRNA表达谱的差异进行比较分析,发现HOTTIP在H69AR耐药细胞株中显著高表达,实时定量PCR证实了 HOTTIP的表达量在H69AR为H69的14.9倍。后续实验发现HOTTIP可以正向调控其协调作用基因HOXA11和HOXA13的表达,与小细胞肺癌细胞耐药、增殖、凋亡、细胞周期、迁移、EMT等表型密切相关,但具体调节机制尚不清楚。新近研究发现miRNAs和lncRNAs之间可能存在交叉调节作用,相当数量的lncRNAs的丰度由miRNAs决定。目前研究发现LncRNA和miRNA两者之间存在的调节机制可能存在有以下3种:(1)miRNA可引起一些LncRNA的降解。比如,miRNA let-7b和HuR可以通过降低宫颈癌细胞中lincRNA-p21的稳定性来抑制其表达。HuR也可以通过招募miRNA let-7降低lncRNA HOTAIR的稳定性[17,18]。(2)LncRNA可以作为miRNA的诱饵分子来间接调控目标基因的表达。如lincRNA-RoR可以与miR-133和miR-135螯合,从而调控miRNA靶基因的表达。这种作用方式被称为“海绵效应”,具备该作用的长链非编码RNA也被称为内源性竞争性 RNA(competing endogenous RNAs,ceRNAs)[19-21]。(3)LncRNA也可以通过产生miRNA,抑制其相关靶基因的表达。如lncRNA H19可以产生miR-675,从而调控其靶基因的表达。因此利用“LncRNA-miRNA-靶基因”这一新颖的调控模式来对肿瘤细胞发生发展进行深入的研究有着重要的意义。课题组利用Arraystar的人LncRNA基因芯片筛选小细胞肺癌耐药相关的LncRNA,发现LINC00213(HOTTIP)在多药耐药细胞H69AR中显著上调,qRT-PCR验证了芯片结果。而后课题组又利用miRNA芯片筛选出了小细胞肺癌耐药相关的若干microRNAs,最终从中选取了在耐药株中低表达的miR-216a进行进一步的研究。因为,通过生物信息预测发现HOTTIP和Bcl-2可能是miR-216a的靶基因,前期研究结果显示HOTTIP可能参与了小细胞肺癌耐药的产生,而Bcl-2作为已经重要的凋亡基因参与对小细胞肺癌细胞耐药性的调控。因此本课题拟在基于小细胞肺癌细胞模型,采用分子生物学和细胞生物学技术,深入分析miR-216a、HOTTIP及Bcl-2三者间的作用关系。通过本项目研究,为丰富非编码RNA参与调节SCLC耐药性的分子机制提供依据。目的:以本课题前期研究结果为基础,采用生物信息学、细胞生物学和分子生物学技术,利用小细胞肺癌耐药细胞模型H69AR、H446DDP和相应的亲本细胞H69、H446细胞,探讨HOTTIP和Bcl-2通过竞争性结合miR-216a参与小细胞肺癌耐药的机制。通过本项目研究,进一步丰富小细胞肺癌耐药的分子机制,为筛选小细胞肺癌耐药及预后的生物学标志物提供理论依据。内容与方法:1、通过miRNA芯片来检测小细胞肺癌耐药株H69AR和敏感株H69之间的miRNA差异表达,并且筛选得到miR-216a,通过实时定量PCR验证miR-216a在H69/H69AR和H446/H446DDP细胞中的表达量是否与miRNA芯片结果一致。2、利用CCK8法分析miR-216a对小细胞肺癌细胞耐药性的影响;通过流式细胞技术检测miR-216a水平的变化与细胞凋亡率和细胞周期之间的关系。3、利用裸鼠皮下成瘤实验检测miR-216a的改变对裸鼠皮下成瘤能力的影响以及移植瘤对药物的敏感性。4、通过生物信息学预测、实时定量PCR、Western Blot、双荧光素酶检测技术、RNA结合蛋白免疫沉淀技术、Pulldown实验验证miR-216a对HOTTIP的靶向关系;通过生物信息学预测、实时定量PCR、Western Blot、双荧光素酶检测技术验证miR-216a对Bcl-2的靶向关系。5、通过实时定量PCR、Western Blot确定HOTTIP表达量变化对Bcl-2蛋白表达的影响;通过荧光素酶技术分析HOTTIP与Bcl-2之间的竞争关系;在改变细胞内HOTTIP表达量的基础上改变miR-216a的表达量,通过Western Blot分析对Bcl-2蛋白表达量的影响,验证HOTTIP对Bcl-2的调控是依赖于miR-216a的,即三者存在内源性竞争性RNA的关系。结果:1、miRNA芯片筛选发现包括miR-216a在内的37个miRNAs在敏感株H69细胞中的表达显著高于多药耐药株H69AR细胞,qRT-PCR结果验证了芯片的准确性,发现miR-216a在小细胞肺癌细胞株H69中的表达是多药耐药株H69AR中的34.5倍(P<0.05),在H446细胞中的表达是H446DDP的27.8倍(P<0.05),提示miR-216a可能参与调节小细胞肺癌的多药耐药性。2、CCK-8实验结果发现上调miR-216a表达量可以降低细胞IC50值,提高细胞对药物的敏感性;而下调miR-216a表达量则可以提高细胞IC50值,降低细胞对药物的敏感性;流式细胞术结果表明上调miR-216a表达量,药物ADM和VP-16诱导的细胞凋亡率明显提高;下调miR-216a表达量,药物ADM和VP-16诱导的细胞凋亡率明显降低;流式细胞术结果还表明上调miR-216a表达量,细胞增殖明显受到抑制;下调miR-216a表达量,细胞增殖明显活跃。3、裸鼠成瘤实验发现上调miR-216a表达量,细胞成瘤能力下降,且对药物更为敏感,瘤体体积缩小快速;下调miR-216a表达量,细胞成瘤能力较强,且耐药性增加,瘤体体积缩小缓慢。4、生物信息学预测HOTTIP和Bcl-2可能为miR-216a的靶基因。通过qRT-PCR分析发现上调miR-216a水平,可引起HOTTIP下调,而下调miR-216a水平会引起HOTTIP上调;通过Western Blot分析发现上调miR-216a表达量,Bcl-2蛋白和Hoxa13蛋白的表达量下降,下调miR-216a表达量,Bcl-2蛋白和Hoxa13蛋白的表达量增加;双荧光素酶实验结果证实了 HOTTIP和Bcl-2均为miR-216a的靶基因。5、通过 RNA 免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)实验和 Pulldown实验分析发现,细胞中Ago2蛋白可以与miR-216a、HOTTIP结合形成RNA诱导沉默复合体。6、qRT-PCR结果显示上调HOTTIP可以使Bcl-2的表达量增加;Western Blot实验也显示上调细胞内HOTTIP表达量,Bcl-2蛋白的表达量增加,而下调细胞内HOTTIP表达量,Bcl-2蛋白的表达量减少;构建H69-HOTTIP-UP-216minics和H69-HOTTIP-DOWN-216inhibitor细胞,在改变HOTTIP水平的基础上,再改变miR-216a的水平,Western Blot结果表明同时上调HOTTIP和miR-216a表达量,Bcl-2蛋白表达量下降;而同时下调HOTTIP和miR-216a表达量,Bcl-2蛋白表达量上升。说明HOTTIP对Bcl-2的调控依赖于miR-216a。结论:1、在人小细胞肺癌耐药细胞株H69AR和H446DDP中,miR-216a低表达;上调miR-216a能在体内外增加细胞对化疗药物的敏感性;下调miR-216a能在体内外降低细胞对化疗药物的敏感性;2、LncRNAHOTTIP和Bcl-2均为miR-216a的靶基因,miR-216a负向调控两者。Bcl-2表达也受到HOTTIP的正向调控,且HOTTIP对Bcl-2的调控依赖于miR-216a。综上所述,HOTTIP可能是通过竞争性结合miR-216a来调控Bcl-2的表达,进而影响SCLC耐药性。