向海鸿雁是吉林省特有物种,常年生活在吉林省向海自然保护区内,2015年向海鸿雁被美国国立生物技术信息中心认定为新物种(Genbank ID:1856198)。依据唐代孙思邈所著的《千金食治》中记载,鸿雁具有“安五脏,益气补中”的功效,本文应用酶解法、膜分离技术、凝胶过滤层析法等生物工程技术获得向海鸿雁雁血蛋白肽组分,并对各组分的免疫活性进行考察,以期开发向海鸿雁免疫活性产品。研究内容如下:利用酶解法提取向海鸿雁雁血酶解产物,优选出复合蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶以1:1:1的质量比例组成)作为工具酶,以单因素实验为基础通过响应面法优化提取雁血蛋白的最佳条件,通过SDS-PAGE电泳考察雁血蛋白在酶解前后的分子量分布情况。结果表明:选用0.10%的柠檬酸三钠作为抗凝剂;酶解最佳工艺条件为酶解温度47℃,p H 7,加酶量4500 U/g,酶解时间5 h,此时水解度为29.29%;利用复合酶酶解制得的向海鸿雁雁血蛋白(PEC),其分子量主要分布在10 k Da。利用膜分离技术纯化向海鸿雁雁血多肽,通过单因素实验确定超滤的最佳工艺条件及膜清洗的最佳方法,通过紫外扫描和氨基酸分析仪对雁血多肽进行分析;采用凝胶过滤层析法分离纯化雁血多肽,通过SDS-PAGE电泳考察雁血多肽分离组分的分子量分布。结果表明:超滤最佳工艺条件为料液浓度25 mg/m L,料液温度40℃,操作时间50 min,操作压力0.20 MPa,p H 6.5;最佳的膜清洗方法为蒸馏水循环30 min,250 ppm Na Cl O碱性溶液在35～40℃下冲洗60 min,0.2%SDS碱性溶液在35～40℃下冲洗60 min,蒸馏水冲洗30 min至中性,此时膜通量恢复率为88.5%;利用膜分离制得的向海鸿雁雁血多肽(PMS)在220 nm处和280 nm处存在吸收峰,并测得其含有17种氨基酸,谷氨酸含量最高约占11.79%,甘氨酸占9.84%,精氨酸占7.28%,缬氨酸占5.47%,提示雁血多肽具有免疫活性;经分离纯化得到分子量分别约为9k Da、7 k Da、5 k Da的三个组分,命名为ACP1、ACP2、ACP3。通过脾淋巴细胞增殖实验、ELISA法检测细胞因子分泌量实验、小鼠体重变化实验、小鼠脏器指数变化实验、迟发型变态反应实验、血清溶血素水平测定实验、巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验,研究PEC、PMS、ACP1、ACP2、ACP3对免疫功能的影响。结果表明:向海鸿雁雁血各组分对免疫功能均有促进作用,PMS在200μg/m L浓度水平下对脾淋巴细胞增殖能力的影响效果最佳(P<0.05),ACP2在200μg/m L浓度水平下对细胞因子分泌量的影响效果最佳(P<0.05),PMS高剂量组对小鼠体重变化、脏器指数变化、迟发型变态反应能力、血清溶血素水平的影响效果最佳(P<0.05),ACP2高剂量组对巨噬细胞吞噬能力效果的影响效果最佳(P<0.05)。根据以上实验结果表明向海鸿雁雁血蛋白肽各组分均具有免疫活性,其中PMS与ACP2具有较好的免疫增强作用,PMS的免疫活性最佳。这可能是由于PMS源于ACP1、ACP2、ACP3的协同增效作用,由此说明向海鸿雁雁血多肽对机体的免疫功能具有一定促进作用。