细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)是一类由基因调控的、有序的细胞死亡现象,广泛存在于动植物中,对生物生长发育、抵抗各类生物及非生物胁迫具有重要作用。在植物中,已鉴定出一系列具有动物caspase样活性和相似结构的PCD调控蛋白,如液泡加工酶(vacuolar processing enzyme, VPE)等。液泡加工酶是一类具有caspase-1活性的半胱氨酸蛋白酶,为蛋白酶C13家族成员。VPE经自我切割产生成熟体后介导植物细胞程序性死亡,然而其具体的互作蛋白以及调控途径仍不清楚。前期研究表明,过表达抗凋亡基因Bcl-2水稻可抑制胁迫诱导的OsVPE2和OsVPE3转录并降低PCD发生,导致抗逆性增强。本研究通过对水稻OsVPE3过表达和干涉转基因株系的鉴定,运用实时定量分析、原生质体细胞膜及液泡染色和免疫共沉淀等技术,进一步探讨OsVPE3基因在盐胁迫诱导PCD通路中的作用机制。取得实验结果如下：1.OsVPE3表达对水稻种子表型的影响通过qRT-PCR鉴定OsVPE3过表达和RNAi抑制转基因株系,并统计T3代转基因纯系种子长宽和千粒重,结果表明抑制OsVPE3表达将引起水稻种子宽度显著减小,千粒重下降。结合OsVPE3表达谱分析,推测OsVPE3可能通过切割贮存蛋白参与种子成熟过程。2.盐胁迫下OsVPE3干涉株系抗盐性提商通过3天高盐处理4周的水稻苗,结果显示OsVPE3干涉株系的存活率比野生型显著提高,且能够维持更多的叶绿素含量。该结果表明抑制OsVPE3的表达可以提高水稻盐胁迫下的抗逆性。3.抑制OsVPE3表达可减弱PCD发生及提高耐盐性高盐处理水稻幼苗3天后,通过对主根相对伸长量的测量统计,以及根尖伊文斯蓝染色发现：与野生型相比,OsVPE3干涉株系根相对伸长量显著增加,根细胞活力较强,死亡较少；而OsVPE3过表达株系与之相反,根相对伸长量减少,细胞活力较弱,死亡较多。DNA laddering检测显示,抑制OsVPE3表达可以明显减弱基因组DNA片段化,而OsVPES过表达会增强基因组DNA片段化。表明抑制OsVPE3表达可减弱PCD发生,从而提高水稻幼苗耐盐性。4.盐胁迫下OsVPE3介导水稻液泡破裂引起PCI)经BCECF-AM和Trypan Blue染色发现,盐处理后野生型原生质体的液泡膜破裂发生于细胞死亡之前,表明液泡的破裂是发生PCD的前奏。而抑制OsVPE3表达可以显著增强液泡膜的稳定性,抑制液泡破裂,提高原生质体存活率。以上结果说明OsVPE3通过调控液泡破裂参与盐胁迫诱导的PCD发生。5.OsVPE3表达对水稻叶片和气孔发育的影响通过观察4周水稻的叶片,发现OsVPE3干涉株系的叶宽明显小于野生型和过表达株系,且失水速率最低。同时,显微观察表明,干涉株系的气孔明显小于其他株系。通过实时定量PCR检测气孔发育相关基因发现,过表达株系中OsTMM, OsSPCH1、OsMUTE和OsFAMA的表达呈显著上调趋势,而干涉株系中,呈现与之相反的显著下调趋势,表明OsVPE3通过影响气孔发育相关基因,使气孔变小,影响叶片蒸腾速率。6.OsVPE3蛋白成熟切割及其互作蛋白研究在原生质体瞬时表达系统中,利用IP技术富集OsVPE3-GFP,发现OsVPE3成熟需进行C端切割。通过免疫共沉淀技术和质谱分析,分离纯化了OsVPE3-GFP及其可能互作的蛋白,推测参与应激反应的DnaK family protein和参与膜泡运输的SNARE protein与OsVPE3互作的可能性最大。以上结果表明：OsVPE3能通过调控液泡破裂参与盐胁迫诱导的细胞程序性死亡,此外,OsVPE3还具有影响种子和气孔发育的作用。