论文部分内容阅读
目的：现研究认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）主要通过宿主免疫应答与免疫反应引起肝细胞的损伤和破坏，由于宿主的免疫反应不同HBV感染所引起的临床表现和转归各不相同。根据免疫学特点，婴幼儿期HBV感染自然过程在临床上可以分为四期，①免疫耐受期；②免疫清除期；③非活动HBV携带状态；④再活动期，目前HBV感染慢性化的确切机制尚不明确。HBV感染后树突状细胞（dendritic cell，DC）抗原提呈功能低下可能是HBV感染慢性化的原因之一。DC是目前所知机体内功能最强的APC（antigen-presenting cell，APC），DC作为机体内免疫反应的始动、调节和效应者，具有激括CD8+CTL和CD4+T辅助细胞的能力，控制着体内免疫反应的过程，因而DC已成为机体免疫应答的中心环节。DC最大特点是能够显著刺激初始T细胞进行增殖，而巨噬细胞和B细胞仅能刺激己活化或记忆性T细胞，所以DC在免疫应答诱导中具有独特地位，是机体免疫应答的始动者。成熟DC可高表达CD80、CD83、CD86和HLA-DR的细胞表面分子。干扰素λ（interferon-λ，IFN-λ）是2003年由美国科学Kotenko和Sheppard等应用生物信息学手段从人的基因组中共同发现的一类新型干扰素，包括IFN-λ1（IL-29），IFN-λ2（IL-28A）和IFN-λ3（IL-28B）。近年研究发现干扰素λ主要来源于DC并且对DC的成熟和功能具有重要调节作用。研究发现IFN-λ1能诱导DC的成熟以及增强它的抗原提呈功能。关于报道干扰素λ在丙型病毒性肝炎中的研究进展很多，但在慢性HBV感染过程中对DC功能的影响在国内外报道很少。本研究旨在探讨干扰素λ1对HBV慢性感染青少年患者免疫耐受期与免疫清除期外周血来源DC细胞功能的影响及临床意义。方法：选取青少年慢性HBV感染者34例，其中免疫耐受期18例，免疫清除组16例，健康对照10例。所有慢性乙型肝炎患者均行肝组织活检，炎症分级为G0G4，纤维化程度分为S0S4。1体外DC培养：留取受试者和正常者新鲜外周静脉血，密度梯度离心法分离PBMC，无血清培养基悬浮沉淀细胞，收集贴壁细胞分三组：单独组（重组人白介素-29）；正常培养组（重组人白介素-4、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）；IFN-λ1组（重组人白介素-4、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组人白介素-29）共同培养，均培养7天。2培养过程中在倒置显微镜下观察各组DC成熟状态3收集成熟DC用PE-DC80、PE-CD83、PE-CD86和PE-HLA-DR抗体进行染色，流式细胞仪检测表达情况。4收集细胞培养上清液，ELISA法检测INF-γ，IL-12分泌情况。结果：1DC形态学观察：PBMC经2-4小时贴壁后，可见部分细胞悬浮，多数为B细胞和外周血DC；单独组（IL-29）在培养第2、5和7天后未见贴壁细胞有形态改变，延长至11天后仍未变化；正常培养组（IL-4、GM-CSF）与IFN-λ1组（IL-4、GM-CSF和IL-29）培养过夜后贴壁细胞数量有所减少，细胞体积小；诱导培养2天后可见贴壁细胞伸展，形态明显改变，培养5天后细胞形态不规则，粗细不等的毛刺多而密，成典型的DC形态；第7天DC表面突起更加明显；在IFN-λ1组（IL-4、GM-CSF和IL-29）可见细胞成簇，并且大量突起交织。2流式细胞术检测细胞表面标志结果：培养7天后，免疫耐受组和免疫清除组DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达均低于正常对照组，差异具有统计学意义（p<0.01）；免疫清除组DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达高于免疫耐受组，差异具有统计学意义（p<0.01）；经过IL-29诱导后DC高表达CD80、CD83、CD86和HLA-DR并且免疫清除期患者的表达明显高于免疫耐受期，差异具有统计学意义（p<0.05）3细胞培养上清液检测结果：免疫清除期比免疫耐受期患者DC分泌IL-12和IFN-γ功能强，但均明显低于正常人，差异具有统计学意义（p<0.05）。通过IL-29联合培养诱导后可显著提高DC分泌IL-12和IFN-γ细胞因子功能，差异具有统计学意义（p<0.05）。结论：1利用患者外周血获取PBMC，运用贴壁培养法去除悬浮细胞可成功获得DC。单独加入IL-29培养不能诱导DC成熟，加入IL-4、GM-CSF联合培养后能明显促进和诱导外周血来源DC的成熟。2慢性HBV感染者中免疫耐受期患者DC功能较正常人和免疫清除期患者明显降低，DC功能的缺失是青少年HBV感染后免疫耐受的原因之一。3经体外IFN-λ1处理后慢性HBV感染者中免疫耐受期和免疫清除患者的DC功能明显增强，IFN-λ1在体外能促进DC成熟和调节DC的抗原提呈功能，IFN-λ1具有很强的免疫调节能力。IFN-λ1有可能成为治疗慢性乙型肝炎的新选择。