研究背景：脑胶质瘤是起源于神经上皮的肿瘤,它是最常见的颅内恶性肿瘤,具有高侵袭性、异型性以及易复发等恶性肿瘤所具备的特性。目前临床上常用的治疗胶质瘤的方法为手术以及放化疗,然而并未对提高患者生存期产生明显效果。在过去的十几年中,胶质瘤患者的中位生存期仍然仅维持在12个月甚至更短。胶质瘤分类方法很多,而其中最常用为根据起源划分,其在临床上最常见的类型为星形细胞瘤。世界卫生组织(WHO)据肿瘤的恶性程度将其进行分类,分别为Ⅰ～Ⅳ4个等级,并将Ⅰ级归类于良性肿瘤,可通过手术切除并达到治愈目的,而且Ⅰ级胶质瘤极少出现恶性进展,患者预后效果良好；Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤则具备一定的侵袭性,肿瘤恶化程度较高；Ⅳ级的恶性化程度最高,相较于Ⅱ、Ⅲ级胶质更具有侵袭性,患者的预后情况也并不理想。通常将原发于脑实质内的定义为原发性胶质母细胞瘤,而继发性胶质母细胞瘤是由低级别的胶质瘤,如Ⅱ、Ⅲ级胶质瘤进一步恶变所形成的。尽管现在已有运用手术切除与放化疗相结合的综合治疗手段对胶质瘤患者进行治疗,然而患者的术后生存期仍然仅为12个月。学者们研究发现胶质瘤易复发的主要原因是由于胶质瘤干细胞对化疗产生一定的抵抗性。随着组织病理学和分子生物学的不断发展,近年来越来越多的学者将焦点集中于对于胶质瘤的基础研究,同时还对胶质母细胞瘤的临床病理异质性、基因的异常表达以及信号传导通路紊乱等一系列分子机制亦进行了深入探索,上述研究有助于我们更全面透彻的了解胶质瘤的发生机制以及进展机制,这对临床上对胶质瘤患者进行诊断和治疗具有十分重要的意义。同时,能够找到有效的治疗胶质瘤的药物或者分子靶向治疗方法成为研究的难点和热点。而其中对于肿瘤侵袭机制的研究成为重中之重。大量研究证实,胶质瘤的发生和发展过程中,多种microRNA能够对对其产生或正或负的调节作用,引起microRNA独特的作用机制引起了学界的广泛关注。微小RNA (microRNAs, miRNAs)属于内源性单链非编码小RNA,包括20～25个核苷酸(nucleotide, nt), miRNA通过与其靶mRNA的3’非编码区(untranslated region, UTR)的互补配对能够起到降解靶mRNA或者抑制其翻译的作用,从而起到调控机体生长和发育、细胞的分化、增殖以及凋亡等生理过程。所以,miRNA与其相应靶基因组成了一个复杂的调控网络,该网络对于细胞及机体的一系列生命活动过程具有非常重要的意义。有研究估算超过百分之五十的miRNAs定位于基因组的脆弱位点或者肿瘤相关基因区域,表明miRNAs可能与肿瘤的发生和发展过程有着极其密切的关系。越来越多的研究证实miRNAs可对恶性肿瘤的生成和进展造成影响,这些影响主要表现为以下三个方面：首先,一部分miRNAs参与了肿瘤的发生和发展过程,具有促癌基因的作用；其次,与促癌基因作用相反,miRNAs还能抑制肿瘤,具有一定的抑癌基因的功能；此外,有报道称一部分被致瘤病毒编码的miRNAs与恶性肿瘤的发生及发展有一定的相关性,细胞中的miRNAs可能在引起肿瘤发生的病毒的生命活动周期中对其产生重要影响,由于病毒寄生于其宿主体内,所以也能调控机体细胞中的miRNA的表达,从而参与肿瘤的发生和发展。miR-10b是miRNAs家族中的成员,大量研究证实其与某些恶性肿瘤的侵袭和转移具有密切关系。目前已报道发现,miR-l0b能在诸多恶性肿瘤中高表达,如胰腺癌、肝癌、转移性乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病等,并且与上述肿瘤细胞的侵袭及转移高度相关。但目前对miR-10b与胶质瘤侵袭和转移相关的研究较少,并且表达结果差异较大。Ras homologous C (RhoC)是Rho是一类具有GTP酶活性的三磷酸鸟苷GTP结合蛋白,是Rho信号传导通路的重要组成部分。RhoC在胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌以及肝癌多种肿瘤组织中均有表达,有研究表明其参与了肿瘤细胞的侵袭和迁移以及转移表型的获得过程。通过一定的方法使RhoC的表达降低,并抑制与其相关的信号通路,可显著的影响肿瘤细胞的侵袭及转移。所以对于RhoC因子作用机制的研究,不仅有利于进一步了解肿瘤侵袭转移机制,且有利于针对这一生物学行为的靶向药物开发。研究目的：探索miR-10b、RhoC在胶质瘤细胞中侵袭及转移中所发挥的作用,并研究其分子机制,以期为临床治疗胶质瘤提供新的有效的靶点。研究方法：(1)荧光定量PCR检测63例胶质瘤患者血清及其癌组织、15例相应正常组织中miR-10b和RhoC mRNA表达；采用western blot对胶质瘤组织及其对照组中RhoC蛋白表达的检测以此来研究胶质瘤组织中RhoC蛋白的表达与临床病理分级是否存在一定的关系。(2)我们选用人胶质瘤U87细胞,采用miR-10b shRNA重组慢病毒载体对其进行转染,转染后U87细胞中miR-10b mRNA勺表达可通过荧光定量PCR进行检测；U87细胞的生长活性采用MTT法进行检测；采用流式细胞术检测转染后各实验组细胞周期的变化,同时对各组细胞凋亡的影响进行一定的评价研究；采用Transwe Ⅱ小室法,平板克隆形成实验,细胞划痕实验及Caspase-3活性检测分别对U87细胞的侵袭性、增殖力、迁移性和凋亡形成机制进行检测。(3)用生物信息学软件预测miR-10b的潜在靶点后,分别将野生型WT-RhoC和突变型Mut-RhoC分别转染已筛选的稳定转染miR-10b抑制剂的人胶质瘤U87细胞；对U87细胞中荧光素酶的表达进行测定并采用荧光定量PCR检测各组细胞RhoC mRNA表达；此外我们采用western blot法对RhoC蛋白的表达进行监测。研究结果：(1)胶质瘤患者血清及其癌组织中miR-10b和RhoC mRNA的表达均显著高于相应正常组织；与正常组织相比,RhoC蛋白在胶质瘤组织中的的表达量显著增高；与此同时LSD法分析表明Ⅲ级以上胶质瘤组织中RhoC蛋白的表达要显著增高,明显区别于Ⅰ级和Ⅱ级；Spearman分析表明胶质痛患者癌组织中RhoC蛋白表达与临床病理分级呈正相关,即在高级别病例组中高表达,在低级别病例组中低表达。(2)为了研究U87细胞生长活性与miR-10b shRNA的表达是否密切相关,我们首先抑制U87细胞中miR-10b shRNA的表达,然后采用MTT法检测转染成功后24h、48h及72h胶质瘤U87细胞的生长状况。结果表明miR-10b shRNA组各时间点U87细胞的生存率与阴性对照组(NC)相比没有显著影响；试验中我们采用流式细胞仪检测各组细胞转染48小时后的细胞周期,实验数据表明转染miR-10b后并未对U87细胞周期产生显著影响。各组细胞在G0/G1期、G2/M期以及S期的细胞比例无显著差别；同样采用Annexin V-PI双染色法结果表明转染miR-10b抑制剂后对U87细胞凋亡无显著影响,而且miR-10b与诱导人胶质瘤U87细胞发生凋亡无关；通过Transwe Ⅱ小室法检测转染48 h后各组细胞的侵袭能力情况,结果表明miR-10b shRNA组与NC组相比视野平均侵袭细胞数量显著减少；通过平板克隆形成实验我们发现miR-10b的表达受到抑制时,细胞克隆的形成能力与NC组无明显差别；采用细胞划痕实验表明未转染miR-10b印制剂的U87细胞的迁移性强于转染miR-10b抑制剂组；运用caspase-3活性检测试剂盒对转染后各组细胞的caspase-3活性进行检测,结果表明与NC组相比,miR-lObshRNA转染组中U87细胞中caspase-3活性并未受到显著影响。(3)对转染后各组细胞中荧光素酶的表达进行测定,结果表明miR-10b的表达量降低时能够显著抑制野生型RhoC的表达,但对突变型RhoC则无显著影响；Western blot法分别对各组细胞中RhoC蛋白的表达情况进行检测,结果表明miR-10b的表达量降低时能够显著抑制野生型WT-RhoC组细胞中RohC蛋白的表达,但对突变型Mut-RhoC则无显著影响。研究结论：本研究通过采集胶质瘤患者外周血及瘤体组织,检测miR-10b以及RHOC的表达,分析miR-10b表达的变化对胶质瘤细胞侵袭和转移的意义,探究miR-10b信号活化对胶质瘤细胞中RHOC表达的调控作用及其对胶质瘤细胞生物学行为的影响,初步阐明人胶质瘤细胞的侵袭和转移的作用机制之一可能是通过miR-10b靶向调控RhoC的表达来实现的。