肠道病毒71型（EV71）是小儿手足口病（HFMD）的主要病原体之一，在世界范围内流行，亚太地区为主要流行区。EV71感染和发病人群主要为5岁以下婴幼儿。EV71感染可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经性肺水肿和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统疾病，有较高的致残率、致死率，被认为是脊髓灰质炎病毒之后影响儿童健康最主要的肠道病毒之一。我国是最早开展EV71疫苗研发的国家，目前3个厂家的全病毒灭活疫苗即将完成Ⅲ期临床试验。但对该疫苗的基础研究较为滞后，免疫机制仍不十分清楚，成为全面评价疫苗免疫原性及安全性的瓶颈。Toll样受体（TLRs），是模式识别受体（PRRs）的一种。处于沟通固有免疫与获得性免疫的核心地位，TLRs信号通路的激活不仅诱导机体产生炎症反应，同时也促进DC的成熟与Th细胞的分化，产生获得性免疫应答病源体入侵机体时与相应的PRRs特异结合，激活体内免疫信号调节通路，最终诱导机体产生炎症反应。在对麻疹、黄热、风疹、乙肝等疫苗免疫机制的研究中，均发现存在特异激活的TLRs信号通路。有研究表明黄热疫苗高效的免疫原性与其可同时激活多条TLRs通路相关。此外将TLRs配体作为更加安全、有效的新型疫苗佐剂的研究也成为疫苗学研究的热点，葛兰素史克公司生产的添加了TLRs配体佐剂-AS04的乙肝疫苗Fendrix已在欧盟获得批准。我国EV71疫苗研发进程居世界领先，但目前仍不了解疫苗诱导免疫应答与TLRs信号通路的关系。本研究成功设计了小鼠TLR4、7和9引物与探针，分别构建了包含TLR4,7,9基因的重组质粒，并在大肠杆菌中成功克隆了该质粒。引物、探针与重组质粒构成了小鼠TLR4、7和9基因检测的定量PCR（Q-PCR）平台。通过微量中和细胞病变法（CPE）对接种EV71抗原的小鼠血清中和抗体水平进行了测定，证明不同EV71抗原在接种剂量下皆可诱导小鼠产生中和抗体，且接种后3d阳转率即达到100%，据此判断TLRs通路的激活应发生在接种后3d内，因而对小鼠TLR4,7,9基因检测应在接种或刺激后3d内进行。运用Q-PCR平台对体外经EV71抗原刺激3d内不同时间点的小鼠脾淋巴细胞中TLR4、7和9基因表达水平进行了定量检测，发现TLR4、7和9基因活化水平在不同EV71抗原中存在差异，提示TLR4、7和9基因在不同EV71抗原免疫应答过程可能发挥不同的作用，并且TLR4、7和9基因活化水平与刺激抗原量之间存在剂量效应关系，该结果在基因敲除小鼠上得到了验证。对TLR4、7和9信号通路在不同EV71疫苗免疫应答过程中活化作用的研究，初步揭示了EV71疫苗的免疫机制。