IP3介导的钙信号在fractalkine诱导小鼠痛觉过敏中的机制探讨

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第一部分不同浓度fractalkine对BV-2小胶质细胞胞内钙离子浓度及其胞内效应的影响目的探讨fractalkine诱导BV-2小胶质细胞胞内钙离子浓度变化的机制及其产生的胞内效应。方法不同浓度fractalkine刺激BV-2小胶质细胞,激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i的变化;1 OnM fractalkine孵育BV-2小胶质细胞(0、30、60、120、240min, westernblot测定p38MAPK、p-p38MAPK的表达;lOnM fractalkine孵育BV-2小胶质细胞0、6、12、24h, RT-PCR及Elisa检测白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-a)基因水平及蛋白水平的表达。预先60s给予fractalkine的受体的拮抗齐anti-CX3CR1和IP3R的拮抗剂2-APB再给予fractalkine,激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i的变化;Westernblot测定p38MAPK、p-p38MAPK的表达;预先60s给予fractalkine的受体的拮抗剂anti-CX3CR1、IP3R的拮抗剂2-APB和p38MAPK的抑制剂再给予fractalkine,Elisa检测白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。结果fractalkine引起BV-2细胞[Ca2+]i增加,p-p38MAPK及其IL-1β、TNF-α表达增加(P<0.01);给与fractalkine受体的拮抗剂anti-CX3CR1、IP3R的拮抗剂2-APB可以抑制fractalkine引起的胞内钙离子浓度的增加,降低p-p38MAPK及其IL-1β、TNF-α表达;给予p38MAPK的抑制剂SB203580降低IL-1β、TNF-α表达。结论fractalkine通过与小胶质细胞上的CX3CR1受体结合,促发小胶质细胞内的IP3钙信号,激活p38MAPK,引起IL-1p和TNF-α表达。第二部分趋化因子fractalkine在热痛敏中作用的实验研究目的探讨趋化因子fractalkine在热痛敏中的作用。方法清洁级成年雄性昆明小鼠分成五组,侧脑室注射生理盐水组、fractalkine组、anti-CX3 CR1+fractalkine组、2-APB+fractalkine组和SB203580+fractalkine组。侧脑室注射0、30、60、120、240min,测量昆明小鼠足底的热痛阈;各组在上述时间点处死小鼠并取脑组织,western blot测定p-p38MAPK及p38MAPK的表达;各组在侧脑室注射0、6、12、24h时处死小鼠并取脑组织,Elisa检测IL-1β和TNF-α的表达;fractalkine组在侧脑室注射0、6、12、24h时处死小鼠并取脑组织,荧光定量RT-PCR检测IL-1β和TNF-α基因表达;侧脑室注射fractalkine 4h时处死小鼠,免疫荧光检测fractalkine作用的靶细胞。结果1. fractalkine组注射60、120、240min,昆明小鼠的热痛阈较其它四组显著性降低(P<0.05)。2.免疫荧光显示外源性的fractalkine通过与小胶质细胞的受体结合与小胶质细胞特异性标记物Iba-1共染色。3. fractalkine组IL-1β、TNF-α蛋白表达较其他四组显著性增加(P<0.05); fractalkine组侧脑室注射6、12.24h,IL-1β、TNF-α的基因表达增强。4.注射30、60、120min, fractalkine组p-p38MAPK蛋白表达较其他四组显著性增加(P<0.05)。结论fractalkine可以通过促发小胶质细胞IP3钙信号,激活p38MAPK,引起IL-1β和TNF-α蛋白表达,导致热痛觉过敏。
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