研究背景肺癌是严重威胁人类健康的疾病,据报道,肺癌高居2009年美国肿瘤死因榜首,而近年来,肺癌发病率、死亡率在中国等发展中国家也持续飙升,就中国广州的肺癌死亡率来看,1970-1972年为11.61/105,而后上升到1980-1982年32.67/105,1990-1992年41.54/105,2000-2002年48.79/105,这些触目惊心的数字迫使研究者们积极地探讨肺癌病因。研究发现,在罹患肺癌的人群中,80%归因于烟草暴露;但吸烟人群中仅10%的人最后发展为肺癌,表明肺癌的形成尽管与环境因素有关,但还取决于个体的遗传易感性。为了分析肺癌的遗传易感因素,当前很多学者致力于分子水平的实验研究,但仍有许多问题有待进一步阐明。miRNA是生物体内一类非编码的小分子RNA,在细胞内经历了从初始miRNA(pri-miRNA)剪切为前体miRNA(pre-miRNA), pre-miRNA再加工为长度约22个碱基的miRNA成熟体的过程。miRNA成熟体主要通过与靶基因3’UTR和5’UTR互补结合来调控靶基因的表达,且研究发现miRNA参与了细胞的癌变过程,例如有报道称人肺癌细胞株中hsa-mir-182结合RGS17基因的3’UTR的两个保守位点来对RGS17基因进行调控。又如, hsa-mir-21的调控功能异常是已知的与许多种癌症发病相关的因素,最近有研究认为,在非小细胞肺癌细胞株中,hsa-mir-21通过结合抑癌基因PTEN的3’UTR来下调PTEN蛋白的表达。再如,有研究以非小细胞肺癌组织为材料,得出K-ras基因的3’UTR上let-7的第6个结合区域(let-7 complementary sites 6,LCS6)的第4个碱基上存在突变(随后通过46个人群实验证明该突变的频率为5.8%,即为单核苷多态,常缩写为SNP)时,let-7与靶点的结合会出现异常,则有增加个体发生非小细胞肺癌遗传易感性的可能性;他们进而检测美国新墨西哥和波士顿地区两个人群中该SNP在病例和对照中的频率分布,发现该SNP与两个适度吸烟人群的非小细胞肺癌发病有关。此外还有很多实验表明靶基因mRNA的3’UTR上出现SNP时会影响癌症的发病风险。miRNA序列上存在SNP时,是否会影响癌症的患病风险,以及miRNA序列上的SNP如何影响癌症的发生,已成为了当今肿瘤分子流行病学领域的一个新课题。有学者系统地扫描了人癌组织和肿瘤细胞株的几百个miRNA的序列,得出一系列的突变位点;后续的细胞试验证实,let-7e前体存在G>A突变(记成熟体5’端下游为+,上游则为-,成熟体miRNA 5’端第一个碱基为+1;该突变位点位前体下游的第19个碱基,记作+91)会导致其成熟体表达量显著下降,进一步发现该突变影响了let-7e从pre-miRNA加工为miRNA成熟体的过程,从而与癌症的发生相关。美国研究人员测定80名患家族遗传性卵巢癌病人的30个候选miRNA的序列,发现了包括hsa-mir-191前体上的C>A(位置记作+24)变异在内的7个突变位点,经软件预测得出hsa-mir-191上的突变会使其二级结构变得不稳定,且与靶点结合的最大自由能也发生了改变;后通过实验证实hsa-mir-191突变后,其成熟体的表达量降低;进一步检测携带该位点突变基因型的患者的12名亲属的基因型,其中有4名携带CA基因型,8名为CC基因型,而4名CA基因型携带者中有2名随后也被诊断患有卵巢癌,另外8名不携带突变基因型的家属则未检出卵巢癌疾患;最后推论hsa-mir-191前体上的C>A变异会影响其调控抑癌基因或癌基因的功能,与卵巢癌的遗传易感性具有潜在的关联。miRNA 5’端的第2-8个核苷酸称为种子序列,种子序列在前体miRNA的加工、成熟、识别靶基因方面起着重要的作用,在与靶基因的mRNA结合时要求进行完全的碱基互补配对。目前Pubmed上报道miRNA成熟体(含种子序列)上的SNP与癌症易感性的文献不足20篇,我们对近千个miRNA进行生物信息学预测也发现种子序列乃至成熟体上的突变都很少,很可能意味着种子序列的保守性对于生物体有举足轻重的作用,因此,倘若种子序列上出现了序列变异,很可能会比pri-miRNA或pre-miRNA上出现序列变异的后果更严重。国外实验证实hsa-miR-125a种子序列上的SNP显著地影响pri-miRNA加工为pre-miRNA的过程,报告基因实验显示该SNP削弱了miRNA介导的翻译抑制功能,使Lin-28蛋白的过度积累而导致乳腺癌的发生。又如hsa-miR-499-3p的种子序列上的SNP(A>G)位点对应的三种基因型,在中国南京女性乳腺癌病人和健康对照中频率分布有统计学差异,研究者经生物信息学推测hsa-miR-499-3p的种子序列上存在SNP时,可能影响该小RNA的功能从而导致疾病的发生。经搜索生物信息数据库发现,中国人群中有4个满足较小的等位基因频率(MAF)大于0.05的SNP位于miRNA成熟体上,分别是:hsa-miR-499-3p,hsa-miR-608,hsa-miR-196a2,hsa-miR-146a,其中hsa-miR-499-3p上的SNP位于种子序列上。生物信息学预测还显示,hsa-miR-499-3p与我们承担国家自然科学基金项目所研究的DNA损伤修复基因NBS1之3’UTR存在互补配对关系。综上所述,本研究拟探讨hsa-miR-499-3p种子序列的遗传变异(rs3746444 A>G)与中国南方人群肺癌发病的关系。研究目的拟研究hsa-miR-499-3p种子序列rs3746444位点A>G的遗传变异与中国南方人群肺癌发病的关联性,再综合相关研究报道讨论该位点与癌症的发病风险;通过生物信息学的预测来解释miRNA种子序列上存在碱基突变时增加癌症发病风险的原因;为相关人群提供肺癌预防、诊断及治疗的生物标志物,并为其他癌症的研究提供借鉴。研究方法(1)采取病例-对照模型,首先收集广州市及周边城市的526例原发性肺癌患者,并从10,000名健康社区居民中随机选取526例与肺癌病例性别相同、年龄相差±1岁、无血缘关系的正常对照;结合已有的文献资料,通过生物信息学分析选择适宜的SNP位点;采用PCR-RFLP技术检测肺癌人群和对照人群的hsa-miR-499-3p种子序列的rs3746444位点的基因型;用SAS 9.13统计软件分析人群的人口学特征、筛选出危险因素、将单因素和基因型进行非条件Logistic回归,校正混杂因素的影响,分析基因变异与肺癌发病的关联及“基因-环境”的交互作用。(2)综合与rs3746444位点遗传变异相关的癌症研究报道进行meta分析,通过合并的效应量来评价该遗传变异与癌症的关联性。(3)试图通过生物信息学的预测来解释miRNA种子序列上存在rs3746444 A>G变异时增加癌症发病风险的原因。研究结果(1)本研究按病理类型分类,526例肺癌中腺癌195例(37.1%),鳞癌180例(34.2%),大细胞肺癌21例(4.0%),小细胞肺癌65例(12.4%),其他如腺鳞癌、混合型肺癌等计65例(12.4%);按病理分期有I期73例(13.9%),II期50例(9.5%),III期173例(32.9%),IV期230例(43.7%)。比较对照组和病例组,年龄和性别均无统计差异(分别为P=0.084和P=0.322)、吸烟情况也有差异(P=0.014),但饮酒者在正常人和患者间的分布无明显差异(P=0.178),家族癌症史在两组间有明显差异(P=0.174)。hsa-miR-499-3p种子序列的rs3746444变异位点(A>G)存在三种基因型(AA、AG、GG),它们在肺癌病例组与对照组中的分布差异具有显著性(P<0.0001);以携带野生型纯合子AA基因型为参照,携带AG基因型个体发生肺癌的危险度可增加32%(校正OR=1.32,95%CI= 1.01-1.81),携带GG基因型的个体患肺癌的危险度更显著地增加了122%(OR= 2.22,95%CI=1.52-3.23);且rs3746444 G变异allele的个数与肺癌发病危险存在显著的剂量反应关系(P-trend=3.04×10-5);分层分析显示,携带rs3746444 G变异基因型的( AG+GG )个体发生肺癌的危险性在年龄>60岁(OR=2.36,95%CI= 1.60-3.49);女性(OR=2.49,95%CI=1.51-4.12);不吸烟(OR=2.12,95%CI=1.43-3.15);不饮酒(OR=1.73,95%CI=1.28-2.34);以及三代以内直系亲属有癌症患病史(OR=1.57,95%CI=1.19-2.07)的人群中更为显著,说明rs3746444 G变异可能是一个与肺癌发病有关的遗传标志。(2)经检索共收集到五个报告rs3746444位点变异与癌症关联性的研究,经meta综合分析的效应,结果表明该位点的变异[AG+GG vs. AA]可增加发生癌症的风险(OR=1.15,95%CI=1.05-1.26,P=0.002)。(3)生物信息学预测,发现抑癌基因ADAMTS9可能是hsa-miR-499-3p的靶基因之一,当hsa-miR-499-3p在rs3746444位点为G allele时,它与ADAMTS9结合的最大自由能mfe -31.1千卡/摩尔,较rs3746444位点为A allele时它与ADAMTS9结合的最大自由能mfe -26.4千卡/摩尔更小,表明其结合稳定,可能使得ADAMTS9更易发生降解。进一步的信息学分析还发现,乳腺癌中ADAMTS9蛋白表达显著低于癌旁组织;肺细胞系经石棉染毒可导致其ADAMTS9基因表达下降;这些变化是否与hsa-miR-499-3p的rs3746444 A>G有关,值得深入探讨。研究结论hsa-mir-499-3p种子序列(rs3746444 A>G)遗传变异可增加人群发生肺癌的危险性,将为肺癌人群防治提供生物标志物。