在水稻杂种优势利用中,“三系法”存在受恢保关系的制约而对种质资源利用率低的问题,而“两系法”受自然温光影响,在极端气候下又存在不育系的繁殖及杂交制种纯度不达标的风险。水稻存在一些不育特性稳定,且不受环境影响的隐性核雄性不育资源,任何育性正常的水稻品种均可作为其恢复系用来生产杂交种。这些优点可以克服目前“三系”和“两系”杂交水稻的不足之处。但是这些雄性不育自身不能保持,限制了其在生产上的应用。目前先锋公司开发的SPT(Seed production technology,SPT)技术及国内的智能不育系技术等解决了上述核雄性不育的保持问题,为水稻的杂种优势利用开辟了新的途径。本研究拟利用CRISPR/Cas9系统定点突变3个水稻雄性不育基因及1个水稻花药特异表达基因,构建用于保持雄性不育材料的工程载体,转化相应的不育突变体,以期创造一套利用隐性核雄性不育的智能不育系统,创制新材料,为水稻杂种优势的利用开辟新途径。具体研究结果如下:1、利用基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统,在水稻优良品种明恢86中分别定点突变了3个雄性不育基因CYP704B2、DPW及TIP2基因。通过对各编辑载体转基因植株的筛选,针对CYP704b2基因共获得了 13种突变类型,其中双等位纯合突变j3-1和双等位杂合突变j3-4、k2-2在T0代表现为花粉完全不育;针对DPW基因共获得了7种突变类型,其中纯合突变O1-4在T0代表现为花粉败育,双等位杂合突变1-1在T1后代中分离出不含转基因成分的完全花粉败育单株,且分离比符合3:1的孟德尔分离规律;针对TIP2基因获得了 14种突变类型,其中双等位杂合或纯合突变M1-1、M1-2、M2-7和M22-9在T0代表现为株型正常而花粉完全不育。2、利用CRISPR/Cas9技术对花药特异性表达基因OsIPK进行了定点突变。通过对转基因植株的筛选,针对1个靶位点,共获得了 16种突变类型,所有突变植株T0和T1并未观察到花粉败育。亚细胞定位显示OsIPK基因在细胞核中特异性表达,另外,还构建了过表达载体,目前已出苗,其基因功能还有待进一步分析。3、为保持经过定点突变获得的CYP704b2突变体的雄性不育特性,将花粉致死基因Dam、野生型CYP704B2基因和抗除草剂基因OsEPSP串联克隆到了植物表达载体pCAMBIA1300上,构建了cyp704b2突变材料的工程载体P1300-UEM-Dam-CYP704B2,为获得cyp 704b2突变材料的保持材料做了技术准备。