甲念珠菌病是由念珠菌引起的一类特殊类型甲病,病原菌以白色念珠菌最多见。临床广泛采用化学药物治疗,但其价格昂贵并存在较严重的毒副作用。前期研究表明,传统中药验方中治疗甲癣等皮肤病的组方：苦参(Radix Sophorae Flavescentis)、土茯苓(Rhizoma Smilacis Glabrae)和白鲜皮(Cortex Dictamni)均对白色念珠菌有较强的抑制作用。咪唑类抗真菌药硝酸咪康唑对白色念珠菌和一些表皮真菌均有良好抗菌作用。为开发新型抗真菌剂,本研究探讨了配方中药有效成分的最佳提取工艺,考察了配方中药提取物与硝酸咪康唑的体外联合抑菌活性,并将二者组成复方制成软膏剂,在此基础上对软膏的质量标准、体外安全性和体外药效学进行研究。主要研究结果如下：1.配方中药的提取工艺研究：通过正交试验考察A(乙醇浓度)、B(提取时间/次)、C(苦参：土茯苓：白鲜皮)、D(固液比)四个因素对配方中药乙醇回流提取工艺的影响,并以提取物对白色念珠菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)为衡量指标,筛选最佳提取工艺；并用化学方法对配方中药提取物进行了成分预试。正交试验结果表明,配方中药提取物的最佳提取工艺为：A3B2C3D1,即70%乙醇,苦参：土茯苓：白鲜皮比例为2:2:1,固液比为1：10,每次提取2h；提取物得率为23%,对白色念珠菌的MIC值为0.195mg·mL-1。成分预试结果表明,配方中药提取物中主要含有多糖、黄酮和生物碱三大类物质。2.中西药联合效应研究：采用棋盘微量稀释法,考察了配方中药提取物和硝酸咪康唑联合用药对白色念珠菌的抑菌活性；通过对不同比例的配方中药提取物与2%硝酸咪康唑溶液的抑菌活性研究,筛选最佳配伍比例。结果表明：联合用药时,配方中药提取物的MIC从单用药时的0.195mg·mL-1降至0.049mg·mL-1；硝酸咪康唑的MIC由单用药时的7.8μg·mL-1降至3.9μg·mL-1；联合抑菌指数为0.751,说明二者联合应用对白色念珠菌表现为相加作用；当二者比例为3:1和4:1时,抑菌效果最好,复方药液MIC均为0.097mg·mL-1,因此选用3:1进行配伍即可。3.复方“克清甲”软膏处方筛选：以配方中药提取物、硝酸咪康唑、尿素、白凡士林、十八醇、吐温80、单硬脂酸甘油酯等为原料,制备O/W型复方“克清甲”软膏。以软膏外观性状、离心试验、耐热和耐寒试验作为评价标准,筛选HLB值、乳化剂及油相用量,优化软膏处方。结果表明：处方最佳HLB值为10.5,混合乳化剂吐温80和单硬脂酸甘油酯用量分别为6%和4%,油相白凡士林和十八醇用量分别为8%和7%时,可制得合格的复方“克清甲”软膏。4.4%复方“克清甲”软膏质量研究：通过性状评价,参照药典方法鉴别尿素和苦参碱,以及用薄层单波长扫描法检测苦参碱含量,从而对软膏的质量标准进行研究。结果表明,本品为稠度适宜,润滑,易于涂布和易洗除的淡黄色软膏；软膏样品经处理后能使湿润的红色石蕊试纸变蓝,加入硫酸铜试液后溶液变成蓝紫色,加入硝酸后产生白色结晶性沉淀,供试品色谱中在与苦参碱对照品色谱相应位置上显同色斑点,表明可成功鉴别软膏中的尿素和苦参碱；苦参碱薄层扫描波长为510nm,回归方程：y=2036.5x+3842.8,R=0.9951,这一试验结果表明苦参碱在1-9μg之间时与吸收面积呈良好线性关系；专属性试验结果显示,阴性对照在样品与苦参碱对照品色谱相应的位置上没有橙红色斑点,表明软膏中其他成分对苦参碱的检测无干扰。经样品检测,4%复方“克清甲”软膏中苦参碱平均含量为0.28%。5.复方“克清甲”软膏体外安全性研究：通过动物皮肤急性毒性试验、皮肤刺激性试验、眼刺激试验及皮肤主动过敏试验,考察复方“克清甲”软膏体外用药的安全性。结果表明,复方“克清甲”软膏外用无急性毒性反应。单次和多次给予受试药物,家兔完整皮肤均未出现红斑或水肿现象；家兔破损皮肤在单次和多次给药时均略见红斑,但停药后完全消退。根据皮肤刺激强度评分标准,单次和多次给药试验的刺激指数均<0.5,因此复方“克清甲”软膏外用对皮肤无刺激性。皮肤主动过敏试验结果表明,阳性致敏物的致敏率为100%,即有极度致敏性；复方软膏组和空白软膏组在致敏接触和激发接触中均未出现任何红斑和水肿等皮肤过敏反应,即致敏率为0,复方“克清甲”软膏外用不产生过敏反应。6.复方“克清甲”软膏体外药效学研究：将正常甲板分为对照组和造模组,造模组甲板又分为不给药组、基质组及药物治疗组(药物治疗组设三个浓度：2%,4%和8%)。把造模组甲板加入到含白色念珠菌的液体培养基中培养2周,采样作病理切片并进行PAS染色观察；同时将软膏与造模病甲充分接触后共同培养,考察复方“克清甲”软膏的体外药效。3周后作病理切片及PAS染色观察。结果如下：与正常甲板相比较,染菌2周后的甲板质地变硬,外观呈褐色；显微镜下,原本致密有序的角蛋白结构被破坏,病变部位与正常结构呈明显分界线。体外药效试验发现,未给药的造模病甲硬角蛋白结构已完全被破坏,出现断裂和空洞,并可见其间成团的真菌：而各浓度药物治疗组的甲切片中仍可见正常结构,从低浓度至高浓度,正常结构越多。对比2%浓度组与基质组切片可知,二者差别不大,说明软膏浓度过低,无法起到很好的治疗作用。8%浓度组的效果明显优于其他浓度组,并且甲板四周的病变部位也逐渐与甲板中层的正常结构分离开来。说明浓度为8%的复方“克清甲”软膏既可达到抑菌目的,对甲层的剥脱效果也好。上述结果表明：已成功建立甲念珠菌病体外病理模型,复方“克清甲”软膏对甲念珠菌病的疗效确切。