目的:1探讨丁香酚、肉桂醛对嗜肺军团菌的抗菌活性及对嗜肺军团菌生物膜的抑制作用。2探讨丁香酚、肉桂醛对嗜肺军团菌动物模型的体内抗菌活性。3探讨丁香酚、肉桂醛对嗜肺军团菌抗菌作用的机制。方法:药品及菌株丁香酚（99%,v/v）、肉桂醛（99%）标准品购自上海源叶生物科技有限公司。嗜肺军团菌血清型1型（ATCC 33152）,由中国医科大学附属盛京医院呼吸科提供。动物雌性6-8周龄SPF级A/J小鼠购自美国Jackson实验室,自由进食和饮水,温度（22±2）℃,湿度40%,明暗周期（8:00²0:00开灯;20:00⁸:00关灯）,一周后进行实验。1、体外抗菌活性测定部分（1）参考CLSI发表的标准微量肉汤稀释法测定MIC及MBC测定:配制不同浓度的丁香酚和肉桂醛溶液,各取50微升加入96孔板,各孔加入50微升浓度为5×10⁵CFU/ml的嗜肺军团菌。37℃温箱生长48小时后观察结果。（2）参考CLSI发表的标准方法制作时间-杀菌曲线测定:在肉汤混合液中分别加入不同剂量的药物使终浓度为1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC、32MIC,加入定量的嗜肺军团菌（6.5×10⁵CFU/ml）,37℃孵育,分别于0h、0.5h、3h、6h、9h、24h取10微升肉汤10倍倍比稀释后接种于BCYE平板,37℃孵育72小时后进行菌落计数。以时间为横坐标,细菌数的对数值为纵坐标,绘制时间-杀菌曲线。（3）联合药敏测定:棋盘法（chequerboard）-微量稀释法:取96孔无菌微孔板,将丁香酚和肉桂醛稀释至不同浓度,加入浓度为5×10⁵CFU/ml军团菌。37℃恒温培养48小时,测定MIC。通过计算部分抑菌浓度指数（FIC）,FIC=联合用药时甲药MIC/单独应用甲药时MIC+联合应用乙药时MIC/单独应用乙药时MIC,FIC指数为≤0.5、>0.5¹、>1²、>2时分别表示协同、相加、无关、拮抗作用。（4）对军团菌生物膜形成的影响和对已形成生物膜的杀菌作用制备生物膜模型,开始孵育时加入不同浓度药物测定药物对生物膜形成的影响,生物膜形成后加入不同浓度的药物测定对已形成生物膜的杀菌作用。2、体内抗菌疗效测定部分（1）军团菌肺炎小鼠模型制备:每只小鼠气管内注射2×10⁶CFU的军团菌,制备肺炎模型。等量生理盐水注射为对照组。模型制备后1小时分别向小鼠腹腔注射丁香酚（160mg/kg/d）和肉桂醛（120mg/kg/d）,连续2天。10只小鼠为一个实验组。另建立气管注入10⁸CFU/只军团菌肺炎模型组、丁香酚治疗组、肉桂醛治疗组,每组5只观察7天,计算生存率。（2）标本采集:在肺炎模型制备后48小时,将小鼠麻醉后摘眼球取血法收集血液标本,无菌条件下分离小鼠肝、脾、肾、肺。（3）细菌培养:将脏器匀浆液各取10μl接种于BCYE平板进行细菌培养,37℃5%CO₂培养72小时后观察平板军团菌生长情况。（4）肺组织病理切片:取每只小鼠的左肺组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,常规HE染色。（5）内毒素测定:用肝素抗凝管留取血标本后立即离心10min（2000转/min,4℃）,取血浆测定内毒素水平。（6）肺组织匀浆液上清促炎性细胞因子TNF-α,IL-1β测定:肺组织置于2毫升生理盐水中,匀浆离心,取上清液用ELISA方法测定TNF-α,IL-1β水平。3、抗菌机制探讨部分（1）OD260处可吸收物质测定:将军团菌与不同浓度药物孵育后测定上清液的OD260。（2）SDS-PAGE电泳:军团菌与不同浓度药物孵育后,将上清液进行SDS-PAGE电泳,银染色及考马斯亮蓝染色。（3）LIVE/DEAD Baclight细菌活力测定评估细菌被膜的完整性。（4）透射电镜观察嗜肺军团菌形态:增菌后军团菌浓度约10⁹CFU/mL,加入丁香酚、肉桂醛,37℃孵育30min,离心,将细菌团块用2.5%戊二醛固定,送中国医科大学电镜中心观察。结果:1、体外抗菌活性测定（1）MIC及MBC测定:丁香酚的药敏结果MIC为0.0125%,MBC与MIC值相同;肉桂醛MIC界于15³0μg/ml之间,MBC为30⁶0μg/ml。（2）时间杀菌曲线:丁香酚浓度为0.1%（8MIC）值及以上浓度时,半小时可将军团菌完全杀灭;浓度为0.05%（4MIC）值时,1.5小时可将军团菌杀灭;浓度为0.0125%（MIC）时,曲线斜率为负值,证明丁香酚为杀菌剂。肉桂醛浓度为1000μg/ml（32MIC）时,1.5小时将军团菌完全杀灭,500μg/ml（16MIC）时,3小时将军团菌完全杀灭,250μg/ml（8MIC）时,6小时将军团菌完全杀灭,125μg/ml（4MIC）时,9小时将军团菌完全杀灭,2MIC时24小时将军团菌完全杀灭,MIC时斜率为负值,亦为杀菌剂。在MIC及2MIC条件下两药抗菌效果相当,但4MIC及以上浓度时肉桂醛抗菌效率较丁香酚差。（3）联合实验:丁香酚与肉桂醛联合实验FIC指数为0.375,<0.5,两药联合应用具有协同作用。（4）对生物膜的影响:丁香酚1/2MIC、1/4MIC浓度可有效抑制嗜肺军团菌生物膜的形成,有统计学意义。肉桂醛对生物膜形成无明显抑制作用。2、体内抗菌活性测定（1）肺内LP负荷量:丁香酚160mg/kg/d组气管内注菌后48小时肺组织匀浆LP负荷量较未用药组减少,丁香酚有助于肺内军团菌的清除。肉桂醛120mg/kg/d组气管内注菌后48小时肺组织匀浆LP负荷量较未用药组无明显下降。（2）LP各脏器的播散情况:丁香酚治疗组血中及脾脏LP的播散比例较肺炎模型组明显减少,肉桂醛治疗组较肺炎模型组无明显变化。（3）肺脏病理改变:军团菌肺炎模型组肺泡间隔水肿增厚,大量中性粒细胞浸润,肺泡结构紊乱、实变。丁香酚治疗组肺泡间隔水肿减轻,中性粒细胞浸润减少。肉桂醛组未见明显变化。（4）血浆内毒素水平测定:丁香酚治疗组明显低于肺炎模型组（p<0.05）,肉桂醛治疗组血浆内毒素水平较肺炎模型组无明显下降。（5）肺组织匀浆液上清细胞因子水平测定:与肺炎模型组相比,丁香酚治疗组肺组织匀浆液上清TNF-α、IL-1β水平明显降低（p<0.05）。肉桂醛治疗组仅观测到TNF-α下降（p<0.05）,IL-1β平均值虽有所下降,但无统计学意义。（6）生存率影响:嗜肺军团菌肺炎致死量10⁸CFU/只,未用药物组第3天全部死亡,肉桂醛治疗组第5天全部死亡,丁香酚治疗组7天时存活2只（40%）,较未用药组差异显著。3、抗菌机制探讨（1）OD260处可吸收物质测定:丁香酚作用军团菌1小时后,0.4%、0.8%浓度OD260较正常组明显升高,肉桂醛、左氧氟沙星组与正常组比较无明显差异。（2）上清液SDS-PAGE电泳:各组上清液SDS-PAGE电泳银染及考马斯亮蓝染色,0.4%、0.8%丁香酚作用于嗜肺军团菌后可见多个蛋白条带,密度较高的为分子量38kDa条带,考马斯亮蓝染色亦可见此条带最清晰。表明丁香酚作用于嗜肺军团菌后,最早和最主要漏出的为分子量38kDa的蛋白。（3）LIVE/DEAD Baclight细菌活力测定:相同浓度的4MIC、8MIC及32MIC条件下丁香酚组具有完整被膜的细菌比率较肉桂醛组明显下降。（4）透射电镜观察嗜肺军团菌形态:平板上生长的正常的嗜肺军团菌为杆状,具有典型革兰阴性杆菌的细胞壁结构,外膜呈波浪状。肉汤培养后LP进入指数后生长期,外膜波状外形更明显,胞浆丰富密度均匀,胞浆内出现较多包涵体,电镜图片表现为胞浆内可见多个空泡。肉桂醛（1mg/ml）作用于LP后细菌外膜尚可见,未看到明显破坏,胞浆密度较高。丁香酚（0.4%）作用于LP后细菌波状外膜消失,胞浆内物质减少,密度降低,并可见膜破坏处胞浆物质外漏。结论:1、丁香酚、肉桂醛对嗜肺军团菌具有较强的抗菌作用。丁香酚与肉桂醛联合应用对嗜肺军团菌的抗菌作用具有协同效应。丁香酚对军团菌生物膜形成具有较强的抑制作用。2、丁香酚治疗嗜肺军团菌肺炎,具有良好的体内抗菌活性。3、丁香酚作用于嗜肺军团菌细菌被膜,导致被膜损伤及细菌死亡。肉桂醛作用于嗜肺军团菌,未明显改变细菌被膜通透性。