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精神分裂症是迄今为止人类所面临的最为常见和最为严重的精神疾患之一,发病机制迄今不明。在人群中的患病率约为1%,约占全球疾病总负担的2.8%。因此,确定精神分裂症的病因并提出相应的预防和治疗策略是当前医学研究中的重大课题。
关于精神分裂症病因,科学家提出了遗传,环境,神经递质等多种假说。因为在多巴胺假说、5-羟色胺假说、γ氨基丁酸假说、谷氨酸假说中都涉及到儿茶酚胺氧位甲基转移酶。并且,在精神分裂症的遗传学研究中,儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因一直是热门的易感基因。所以,我们结合精神分裂症的神经递质假说和遗传方面的假说,选择儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因为研究对象,从基因水平和蛋白质水平对精神分裂症的发病机制作了一个初步的探讨。
儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因定位于人类第22号染色体,含有六个外显子。其表达的蛋白分为膜结合型和分泌型两种,两种蛋白由同一基因编码,但由不同的启动子启动。分泌型包含211个氨基酸,比膜结合型在N端少50个氨基酸。从基因水平上来讲,就是膜结合型包含了所有第一至第六外显子,而分泌型COMT蛋白质只包含了第二至第六外显子。在人体内,其存在形式主要为分泌型,占99%以上。
儿茶酚胺甲基转移酶作用底物广泛,凡是具有邻二羟基苯环结构的物质均可被其催化。人体内儿茶酚胺氧位甲基转移酶的主要功能在多巴胺,肾上腺素,去甲肾上腺素等神经递质的分解代谢中,在甲基供体存在的情况下,将甲基转移至这些神经递质的3位或者4位羟基上,从而使这些神经递质失活。
实验中选择经过副主任医师以上人员检查确诊(CCMD-Ⅱ-R诊断标准),并采用神经精神病学临床评定表(SCAN)检查同时符合国际疾病分类第十版(ICD-10)中偏执型精神分裂症的诊断标准的精神分裂症患者80例,健康志愿者108名作为研究对象。对这些患者儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因第二至第六外显子进行了全面的遗传筛查。结果在病例组发现野生分泌型COMT的Ala22G/T突变2例,这种突变导致Ala22改变为Ser22;在Val108位点发现G/T突变1例,导致Val108改变至Met108。
筛查到这些突变后,以Pet22b+为载体,构建了原核表达质粒No-COMT、Se-COMT、Me-COMT。分别代表野生型、Ser22突变型、Met108突变型质粒。通过酶切及测序鉴定,序列正确。然后将三种质粒分别转化表达菌株BL21*DE3,优化表达条件,这三种蛋白均得到良好表达。经过亲和层析纯化后,纯度达95%以上。所表达蛋白经SDS-PAGE,Westernblot鉴定证明确系儿茶酚胺氧位甲基转移酶蛋白。
分别取纯化后的三种蛋白,以3,4-二羟基苯乙酸为底物,AdoMet为甲基供体,优化酶学反应条件,用HPLC分离反应后的各种产物,以电化学检测器检测,对此三种蛋白进行酶学活性研究。因为在各次酶学反应中,加入了相同的底物量、酶量,所以在反应体系中,剩余底物(峰1),生成产物3-羟基-4-甲基苯乙酸(峰2)、3-甲基-4-羟基苯乙酸(峰3)的总量是一致的。因此我们将酶活性定义为所生成产物3-羟基-4-甲基苯乙酸,3-甲基-4-羟基苯乙酸(峰2,峰3)占所有3个峰比例。发现这三种突变体No-COMT、Me-COMT、Se-COMT之间,酶活性差异较大。相对活性分别为:10.60%,23.95%,69.49%。因此,认为COMT基因Ser22,Met108位突变导致了COMT酶活性的变化,可能是精神分裂症的致病因素之一。