平菇转录调控因子areA、nmrA的克隆与分析

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平菇作为我国栽培面积最广的食用菌,在其生长发育过程中需要氮源、碳源、水、无机盐、生长因子五营养要素以及适宜的碳氮比(C:N)。氮源作为平菇主要的营养元素,对其生长发育起着至关重要的作用。目前,针对平菇氮代谢的转录调控机制研究尚属空白。本文通过NCBI对平菇的全基因组进行分析,获得areA、nmrA基因的相关信息。以平菇新831为研究对象,对areA、nmrA056、nmrA060基因进行如下研究:扩增获得areA、nmrA056、nmrA060基因的CDS区;对其进行生物信息学分析,了解基因及其编码产物的基本信息;构建异源表达载体进行异源表达;通过RT-q PCR的方法对其进行差异表达分析;利用酵母双杂交技术,对AreA与NmrA蛋白进行互作研究;构建过表达载体、反义沉默载体,为深入研究3个基因的功能的奠定基础。本文主要研究结果如下:1. 本文分别以铵态氮、L-Glu、L-Gln、硝态氮、尿素和精氨酸作为唯一氮源,测定了不同形态氮源对平菇菌丝生长的影响。结果显示:菌丝在优先氮源(铵态氮、L-Glu、L-Gln)中的生长显著优于在次级氮源(硝态氮、尿素和精氨酸)中的生长。2. 以平菇新831菌丝体cDNA为模板,成功克隆到areA、nmrA056、nmrA060基因的CDS区,结果显示:areA基因CDS区全长为3,066 bp,编码1,021 aa;nmrA056基因CDS区全长为1,083 bp,编码361 aa;nmrA060基因CDS区全长为1,146 bp,编码382 aa。3. 对areA、nmrA056、nmrA060基因的结构及其编码产物的功能结构域和亚细胞定位等进行预测,结果显示:areA基因含有5个内含子、6个外显子及3’UTR;AreA蛋白的第585至第608 aa区域为核定位信号(NLS),且亚细胞定位结果显示其位于核内;在AreA蛋白的C端,含有一个典型的GATA锌指结构域:C-X2-C-X17-C-X2-C。nmrA056和nmrA060基因均含有3个内含子和4个外显子,亚细胞定位结果显示其均位于细胞质内;在NmrA056和NmrA060蛋白中均含有NAPD结合位点和调控结合位点。4. 分别构建了areA1566、nmrA056、nmrA060基因的原核表达载体,对其诱导表达,SDS-PAGE结果显示:AreA1566、NmrA056、NmrA060蛋白的分子量分别为54 k Da、40 k Da、43 k Da,均与预期相符。5. 对areA、nmrA060基因进行了差异表达分析,结果显示areA基因在次级氮源中的表达量相对较高;nmrA060基因在优先氮源中的表达量相对较高。6. 分别构建了areA1566、nmrA056、nmrA060基因的酵母双杂载体,初步结果显示:AreA1566蛋白与NmrA056蛋白、NmrA060蛋白之间可能不存在互作关系。7. 分别构建了areA、nmrA056基因的过表达与反义沉默载体,并通过农杆菌介导遗传转化方法转化了平菇,目前已得到若干拟转化子。
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