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玉米灰斑病是一种全球性的玉米叶部病害,严重影响玉米的产量和品质。近年来灰斑病在我国迅速蔓延,已严重威胁到玉米生产,特别是在西南玉米产区,灰斑病已成为危害最严重的病害,一般年份减产10-30%,大爆发时可达60-80%,甚至绝产。发掘抗灰斑病QTL(QuantitativeTrait Locus),培育抗性品种是防治灰斑病最经济有效的途径。前期研究中,我们利用高感亲本Q11和高抗亲本Y32组配的分离群体(F2,F2:3)定位到一个主效QTL(qRgls2),位于5号染色体5.03-5.04 bin,物理距离-110 Mb,可以解释表型变异率18.9-23.9%。在此基础上,我们筛选定位区间内的交换单株与Q11回交,测定回交后代群体的基因型和抗病性,开展qRgls2的精细定位,如此连续多年多代进行,逐步缩小qRgls2区间。鉴于qRgls2位于着丝粒区域,重组频率低,获得交换单株困难等特点,我们同时尝试借助关联分析和转录组测序来确定qRgls2的候选基因。主要研究结果如下:1、在qRgls2区域内加密分子标记,选用其中的23个标记进行qRgls2的精细定位。2、2010-2011年,在F4群体中筛选到22个交换个体,回交后得到1,688个BC1F4单株,种植于云南省保山市进行抗病性鉴定。结合每个单株的基因型,将qRgls2限定在分子标记B96和x157之间,对照B73 RefGen_v2参考基因组序列,其物理距离为～62Mb。3、2011-2012年,在BC2F5群体中筛选到32个交换单株,使用16个分子标记检测交换位点,将它们划分成18种交换类型。检测每个单株的基因型并调查性状,将qRgls2定位于分子标记G386和IDP41之间,物理距离-3.9 Mb。4、2012-2013年,利用来自42个BC2F6交换单株的5,631个BC3F6单株进行精细定位。用14个分子标记将交换单株分成17种交换类型。最终将qRgls2定位在分子标记G346和DD11之间,物理距离-1Mb。5、在精细定位的同时,于2011-2013年间对qRgls2的效应值进行分析,发现该位点能提高灰斑病抗病率20.6-24.6%,且年份间该遗传效应稳定存在。6、根据B73 RefGen_v2的基因注释版本5b.60,在qRgls2精细定位区间内搜索到15个功能基因。其中一个基因GRMZM2G157068编码钙依赖蛋白激酶(CDPK),功能预测显示该基因与生物胁迫相关。7、关联分析发现与灰斑病抗性显著相关的基因内SNPs与连锁分析中的QTLs位置不重叠。同样的,qRgls2精细定位区域内的SNPs位点都未达到显著水平。8、与未接菌的对照比较,接菌处理后二亲本(Q11和Y32)中分别获得的差异表达基因(DEGs)均在氧化还原反应相关的Gene Ontology(GO)中存在富集,在激素调控和次级代谢途径中也有DEGs的富集,说明这些途径可能对调控灰斑病抗性发挥着重要作用。qRgls2区间内有七个功能基因的转录本含量在接菌前后发生显著变化,结合这些基因的功能注释,我们认为CDPK基因最有可能是候选基因。