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胸腺素β4是胸腺素的有效组分之一,为1981年Low等人从小牛胸腺中提取分离纯化的,高度保守,由43个氨基酸组成,N端丝氨酸被乙酰化,等电点为5.1,具有免疫调节的功能,是一种在多种组织均有表达的蛋白多肽,在体液,血液中均存在。大量的研究表明胸腺素β4能够诱导内皮细胞分化,促进血管生成,并能促进创伤的愈合和心肌梗塞时心肌细胞的存活和血管生成。胸腺素β4在治疗皮肤、角膜创伤,治疗心肌梗塞,抗肿瘤治疗,抗炎等方面有着广阔的应用前景,目前胸腺素β4在治疗创伤、心肌梗塞等方面已经进入临床试验。由于天然状态下胸腺素β4含量稀少,从组织中纯化它的成本较高;化学合成方法可以获得,但是价格昂贵。因此,本文利用基因工程技术对胸腺素β4在大肠杆菌中的表达进行了研究,以期为进一步研究其生物学功能奠定基础。(一)人胸腺素β4在原核系统中的克隆、表达及纯化首先按照大肠杆菌密码子嗜性对人胸腺素β4的基因序列进行改造,用化学法合成人胸腺素β4全基因序列,PCR方法扩增人胸腺素β4基因并在其两端引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点。将PCR扩增产物克隆至pGEM-T载体,转化DH5a,抽提质粒,测序鉴定,把序列正确质粒上的胸腺素β4基因亚克隆至原核表达载体pTXB1,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导表达,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的50%,经过超声裂解,亲和层析,柱上裂解释放目的蛋白,超滤,脱盐等处理得到重组人胸腺素β4纯品。纯化的胸腺素β4经Tricine-SDS-PAGE电泳分析只有一条带,纯度在90%以上。(二)人胸腺素β4蛋白理化特性的研究用Edman降解法对重组人胸腺素β4纯品N端5个氨基酸测定,测序结果显示重组蛋白的N端5个氨基酸为SDKPD,与天然胸腺素β4的一致;用ABI公司质谱仪对重组蛋白分析,分析结果显示重组蛋白具有预期的分子量,胰蛋白酶酶切肽谱测定结果显示肽质量图谱匹配良好,这些结果表明重组蛋白就是人胸腺素β4。(三)人胸腺素β4生物学活性检测人胸腺素β4具有免疫调节的作用。参照相关文献,用淋巴细胞转化试验来检测重组蛋白的生物学活性。本研究首先优化了刀豆素A的最佳刺激浓度,选用终浓度4ug/ml的刀豆素A刺激淋巴细胞6小时,然后加入不同浓度的重组人胸腺素β4继续培养至72小时,用MTT法检测细胞的增殖。与化学合成的人胸腺素β4相比,重组人胸腺素β4具有相当的生物学活性。(四)人胸腺素β4在创伤愈合中的促进作用参照相关文献,在Balb/c小鼠身上制造皮肤创伤模型,局部使用重组人胸腺素β4,组织学检测表明重组人胸腺素β4能够促进创伤区域表皮细胞的迁移,促进血管的生成和胶原的沉积。因此本文表达纯化方法制备的重组人胸腺素β4具有促进皮肤创伤愈合的作用。