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研究目的:通过靶向抑制Pin1,探讨Pin1在肝癌细胞对Sorafenib药物抗性中所起的作用,为肝癌的诊断和治疗提供新的思路。研究方法:1.探索肝癌细胞中Sorafenib加药情况下Pin1的表达:Western Blot以及QPCR技术检测Pin1蛋白质或者mRNA的表达情况。2.通过慢病毒包装、感染、筛选,获得Pin1基因敲减的不同肝癌细胞株。通过PI/Hoechst双染检测干扰Pin1表达后的细胞株在Sorafenib加药的情况下,细胞死亡情况以及Western Blot检测相关蛋白的表达情况。3.在肝癌细胞中用Pin1抑制剂ATRA与Sorafenib联合用药后,Western Blot检测Pin1蛋白的表达。通过PI/Hoechst双染以及流式细胞技术检测细胞死亡,Western Blot检测死亡相关蛋白的表达情况。4.通过添加不同的死亡抑制剂的方法检测ATRA与Sorafenib联合用药后细胞死亡的方式,Western Blot检测死亡相关蛋白Caspase3/9的表达情况。5.动物实验,Huh7细胞皮下注射到裸鼠背部,待成瘤后,随机分为四组,分别为Sorafenib单药处理组,ATRA缓释片单药处理组以及ATRA缓释片与Sorafenib联合用药处理组,生理盐水注射组为对照组,检测小鼠瘤块的生长情况,取瘤块进行Western Blot实验,检测相关蛋白的表达。研究结果:1.在多株肝癌细胞中,Western Blot与QPCR检测结果显示Sorafenib加药不仅抑制Pin1蛋白质的合成,而且下调Pin1的mRNA水平。2.成功筛选出了稳定敲减Pin1的HepG2,Huh7,SK-Hep1肝癌细胞株。PI/Hoechst双染以及流式细胞技术检测细胞死亡结果显示,Sorafenib加药后,Pin1敲减细胞株死亡率较对照组明显提高。Pin1敲减细胞株中相关凋亡蛋白的表达量较对照组高。3.Pin1抑制剂ATRA与Sorafenib联合处理细胞后,ATRA明显增强Sorafenib诱导的Pin1蛋白的下调。PI与Hochest双染以及流式细胞技术检测结果均表明Pin1抑制剂ATRA与Sorafenib联合用药处理情况下,明显增强Sorafenib诱导的肝癌细胞死亡,而且肝癌细胞中的凋亡蛋白Caspase3/9出现明显上调。4.Pin1抑制剂ATRA与Sorafenib联合用药情况下,添加的多种死亡抑制剂中只有凋亡抑制剂zVAD能够降低细胞死亡率,而且具有浓度梯度依赖性。5.结果显示,与对照组相比,ATRA单独加药对肿瘤并没有明显的影响,Sorafenib单独加药组,小鼠瘤块在早期并没有受到明显的抑制,抑制作用在晚期才出现;Sorafenib与ATRA联合用药组,早期瘤块就受到明显抑制,而且不仅小鼠瘤块生长受到明显抑制,肿瘤的体积也明显缩小。ATRA有效地增强Sorafenib抑制小鼠体内肝肿瘤生长的作用。结论:根据我们的结果,Sorafenib在肝癌细胞中能够从蛋白水平以及mRNA水平下调Pin1,而且Pin1受到抑制后,Sorafenib诱导的肝癌细胞死亡效率明显提高,因此,我们假设Pin1很可能是Sorafenib抗肿瘤作用中的重要因素。Pin1抑制剂ATRA的应用进一步证明了这一点,两者的联合用药有效的提高肝癌细胞的死亡效率,我们也证明了这种死亡方式可能是细胞凋亡。我们的结果也证实了Pin1在这种细胞死亡过程中发挥着重要作用。因此,Pin1抑制剂的应用有可能为临床上提高Sorafenib对肝癌的疗效做出新贡献。