尘肺是我国危害最严重，患病率最高的职业病，是由于长期吸入矽尘，煤矽尘，煤尘，金属尘等无机粉尘导致在肺内潴留继而引起的以肺组织弥漫不可逆性纤维化为主要特征的全身性疾病。我国报告的尘肺病例尤以煤工尘肺和矽肺的发病率最高。迄今为止，尘肺病没有特效的治疗方法，疾病不仅仅给个人造成身体危害，给家庭带来沉重的负担，还给社会带来重大的疾病负担，造成国民经济较大的损失，因此研究疾病的发病机制，对于尘肺病的早期诊断、治疗及预防起着十分重要的作用。　　有研究表明，肺泡上皮细胞到间质细胞的转化，即上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肺纤维化中有着举足轻重的作用。EMT的过程可以简单归纳为上皮细胞失去极性，标记物 E-钙粘素（E-cadherin）等表达下调，细胞骨架重新排列，形态改变为纺锤形，间叶标记物波形蛋白（vimentin），α-肌动蛋白（α-SMA）等表达上调，最后具有间叶细胞的特性，致使多种细胞外基质沉积。既往研究显示在这个复杂的过程中，TGF-β是其关键启动因子。　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为19-25nt内源性的非编码小分子RNA，通过与其目的基因mRNA3’非编码区（3’UTR）特定区域配对结合，使得目的基因降解又或是抑制目的基因的翻译，进而在基因转录后水平上调控靶基因的表达。近年来，陆续有报道发现多种miRNA可以通过调控某些靶基因从而影响EMT的发生和发展，目前研究比较成熟的主要有miR-200家族，miR-29家族和miR-21。尽管这几个miRNA与器官纤维化的研究已经开展了不少，且调控EMT的相关报道也在不断扩展，但这些miRNA在尘肺病的发生和进展过程中作用的研究还很缺乏。本研究试图探讨EMT在尘肺病的发生与发展中的机制以及miRNA在此过程中的调控作用。　　本研究包括三个部分，第一部分通过检测尘肺病人、健康接尘工人和未接尘健康对照人群全血中EMT相关标记物的mRNA水平，血浆中细胞外基质相关蛋白的表达以及miR-200c、miR-29c和miR-21的水平，分析EMT相关标志物mRNA及细胞外基质相关蛋白表达量与三种miRNA的关系，确认EMT现象与尘肺发病存在关联，获得EMT相关标志物的变化与三种miRNA的关系。第二部分采用体外细胞实验，用呼吸性标准石英粉尘体外刺激肺上皮细胞，检测 EMT相关基因和细胞外基质相关蛋白的水平，并通过拮抗TGF-β分析TGF-β在石英粉尘诱导上皮细胞EMT中的作用。第三部分采用第二部分模型，用石英粉尘刺激肺上皮细胞，测定miR-200c、miR-29c和miR-21的表达，通过观察添加miR-200c和miR-29c的模拟物以及miR-21的抑制剂后 EMT相关基因 mRNA水平和细胞外基质相关蛋白表达的变化，进一步分析三种miRNA对 EMT的调控作用及其对纤维化的影响，为尘肺发病机制研究提供新线索。　　第一部分 MiR-200c、 miR-29c和miR-21介导EMT在尘肺发病中的作用　　目的：通过病例对照研究探讨miR-200c、miR-29c和miR-21及其介导的EMT在尘肺病中的表现及作用。　　方法：研究病例为湖北省黄石地区222例男性尘肺患者（矽肺78例、煤工尘肺144例），均由当地有资质的职业病诊断结构确诊。根据性别和年龄匹配与病例来自同一地区的218例健康接尘工人和225例健康不接尘对照，收集研究对象个人基本信息和职业接尘信息并采集外周血样提取 RNA，分离血浆。采用 RT-PCR法测定血样中EMT相关标志物的mRNA及血浆中miR-200c、miR-29c、miR-21的表达，用ELISA方法检测血浆中细胞外基质相关蛋白的水平。　　结果：1.与健康对照相比，尘肺患者与健康接尘工人全血中上皮标志物E-cadherin，Zo-1基因 mRNA表达降低，间质标志物α-SMA，Vimentin基因 mRNA表达升高。调控EMT的重要通路：TGF-β/Smad依赖通路上的TGF-β1，Smad2，Smad3基因 mRNA表达升高，抑制基因Smad7 mRNA表达降低；非TGF-β/Smad依赖通路上的Notch-1，Jagged-1，β-catenin基因 mRNA表达都有升高趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。提示EMT现象在尘肺患者中存在，TGF-β/Smad依赖通路和非TGF-β/Smad依赖通路均可能参与粉尘引起的EMT。　　2.尘肺患者和健康接尘工人血浆中EMT启动因子TGF-β，细胞外基质相关蛋白包括MMP-2、MMP-9、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ的水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），说明尘肺患者存在细胞外基质沉积现象。　　3.尘肺患者和健康接尘工人血浆中miR-200c及miR-29c的表达量要明显低于健康对照组，miR-21的水平要显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。　　4.矽肺病患者和煤工尘肺患者全血中EMT相关基因mRNA以及三种miRNA的水平不尽相同。矽肺组的变化趋势要强于煤工尘肺组，特别是在三种miRNA的表达上，矽肺组的miR-200c和miR-29c的水平要比煤工尘肺组更低，miR-21的水平要比煤工尘肺组更高，差异有统计学意义（P<0.05）。提示三种miRNA在不同类型粉尘导致的不同类型的尘肺中存在差异。　　5.在所有样本中，miR-200c、miR-29c及miR-21的表达与EMT相关基因mRNA及细胞外基质相关蛋白的水平有相关性（P<0.05）。特别是与细胞外基质相关蛋白的表达量相关系数较大，r值在0.595-0.778之间。　　结论：EMT过程不仅在尘肺发病后存在，且在接尘发病前就已经开始。MiR-200c、miR-29c及miR-21参与调控尘肺病中EMT的发生，起着重要的作用。EMT程度在不同类型粉尘导致的不同类型的尘肺中存在差异。　　第二部分石英粉尘致肺部上皮细胞EMT的发生在纤维化中的作用研究　　目的：通过体外细胞模型研究石英粉尘致肺部上皮细胞EMT的发生在纤维化中的作用，并探讨TGF-β对此作用的影响。　　方法：以两种肺部上皮细胞（A549, BEAS-2B）作为靶细胞。选取粒径小于1μm的标准石英粉尘配置成浓度为0，12.5，25，50，100，200μg/cm2的粉尘悬液，分别染毒两种细胞24h后，RT-PCR方法检测EMT及细胞外基质相关基因mRNA的水平，ELISA方法检测上清液中细胞外基质相关蛋白的表达。为分析TGF-β的作用，上述染尘细胞组分别加入15，30ng/ml两种浓度TGF-β抑制剂LY2157299，重复测定相关指标。　　结果：石英粉尘能够诱导A549和BEAS-2B细胞上皮标志物E-cadherin，Zo-1基因mRNA表达降低，间质标志物α-SMA，Vimentin基因mRNA表达增加，差异有统计学意义（P<0.05）。EMT启动因子TGF-β及细胞外基质相关基因MMP-2、MMP-9、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ无论是mRNA水平还是蛋白水平都随粉尘浓度的升高而增加，呈现剂量反应关系，差异有统计学意义（P<0.05）。两种细胞的变化趋势较一致。　　加入TGF-β抑制剂LY2157299后，上皮标志物mRNA降低的趋势以及间质标志物mRNA升高的趋势得到控制，细胞外基质相关基因mRNA及蛋白水平升高的趋势也得到了缓解。提示TGF-β是石英粉尘致肺上皮细胞EMT发生的关键调节因子。　　结论：石英粉尘可以诱导A549和BEAS-2B两种肺上皮细胞发生EMT变化，导致细胞外基质的沉积。阻断TGF-β的表达，EMT及细胞外基质沉积程度得到控制，提示石英粉尘能够诱导肺上皮细胞EMT的发生，且此过程可部分通过释放TGF-β来实现。　　第三部分 MiR-200c、miR-29c、miR-21调控石英粉尘致肺部上皮细胞EMT的作用研究　　目的：体外细胞模型探讨miR-200c、miR-29c、miR-21在石英致肺部上皮细胞EMT发生中的作用。　　方法：用上述6种浓度的标准石英粉尘悬液分别加入A549和BEAS-2B细胞培养24h，RT-PCR方法检测细胞miR-200c、miR-29c和miR-21的水平。同时，设置分别添加miR-200c、miR-29c模拟物和miR-21抑制剂后的浓度梯度染尘组，测定指标同第二部分。　　结果：随石英粉尘浓度的增加，两类细胞的miR-200c、miR-29c水平降低，miR-21水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。添加miR-200c、miR-29c模拟物和抑制miR-21后，检测EMT相关基因mRNA，细胞外基质相关基因mRNA及蛋白的表达，发现上皮标志物E-cadherin，Zo-1基因mRNA表达降低的趋势得到控制，间质标志物α-SMA，Vimentin基因mRNA表达增加的趋势得到缓解。EMT启动因子TGF-β及细胞外基质相关基因MMP-2、MMP-9、Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ无论是mRNA水平还是蛋白水平随粉尘浓度升高而增加的趋势明显减弱，差异都有统计学意义（P<0.05）。　　结论：MiR-200c、miR-29c和miR-21参与调控石英粉尘诱导的肺上皮细胞发生的上皮间质转化。通过对这三种miRNA的干预可以降低石英粉尘导致的上皮细胞向间质细胞转化的趋势，此结果对尘肺病的预防与治疗提供理论依据。　　本研究通过人群研究和细胞实验发现生产性粉尘特别是石英粉尘能通过释放TGF-β从而诱导EMT的发生，且这个过程受到三种miRNA：miR-200c、miR-29c和miR-21的调控。研究的创新特色包括：1.采用人群研究和细胞实验相结合的研究方法；2.据我们所知，本研究首次采用尘肺患者外周血为研究对象检测EMT相关基因mRNA的改变；3.采用石英粉尘给药体外细胞造模，通过外源性补充miR-200c、miR-29c的模拟物或者抑制miR-21的表达进一步分析三种miRNA调控EMT的作用。　　本研究后期拟通过动物实验分析三种miRNA水平对石英导致的EMT发生的影响。