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研究背景体外循环的发明使心脏外科的发展出现了一个新的飞跃,心脏外科医生可以在一个无血、安静的手术野里,对心脏的畸形和病变进行有效的治疗和处理,但是由于主动脉的阻断,心脏处于一个缺血、停跳的状态,手术中必须对心脏采取一个有效的保护措施,使心脏避免或减少由于缺血／再灌注引起的损伤。应用低温使心脏氧需减少及含钾液体灌注使心脏电机械停博是心肌保护的里程碑。上世纪80年代开始应用含血停跳液,对于保护心肌功能和减少心肌酶的释放优于冷晶体停跳液。目前心肌保护液层出不穷,但是仍然表现出不同的缺陷,对心肌的保护不够理想,体外循环时间一旦过长,手术的危险性成倍增加。如何减轻心肌缺血／再灌注损伤成为一个重要的临床问题,越来越受到心脏外科医生和体外循环灌注师的重视。但长期以来,心脏外科对心肌保护的方法都是外源性的。最近,有些学者开始注意研究内源性保护机制,经研究发现提高了心肌细胞自身对缺血、缺氧的耐受能力。缺血预处理是目前公认的最强的内源性心肌保护措施,但其确切机制尚未清楚,在临床应用中亦存在诸多不便。人们在缺血预处理研究基础之上,尝试利用药物模拟这种内源性抗损伤能力,从而达到心肌保护效果,称为药物预处理。药物预处理已经成为心肌保护研究的热点,研究表明许多药物如腺苷、单磷酰酯A、K-ATP通道开放剂、吸入性麻醉药和阿片类麻醉药等均可以模拟缺血预处理产生心脏保护作用。动物试验大多证实药物预处理的心肌保护作用,但是人们应用动物实验有效地预处理方法进行临床试验,没有得到满意的结果。原因可能是多方面,重要的原因是大部分药物预处理确切作用机制仍不清楚,以及缺乏必要的药理学研究和大组随机、双盲、对照、多中心的临床观察结果,因而目前尚无一种模拟预处理的药物获准注册进入临床,如何获得安全、高效、适于预处理临床应用的药物仍有待进一步研究和探索。由于药物预处理模型有较好的可控性、重复性,且药物预处理无明显毒副作用及创伤性,血流动力学改变轻微而实验对象易于耐受,故有利于预处理的实际推广应用。深入研究药物预处理的心肌保护作用机制,有利于探讨心肌内源性保护的病理生理机制。随着缺血预处理机制的进一步阐明,药物预处理具有广阔的临床应用前景。我们先前的研究已经证实在心肌遭受缺血冷停跳之前24小时,由大鼠腹腔注入L-精氨酸和NO合成酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME),取得了模拟心肌缺血预处理第二窗的心肌保护作用,在心肌保护液的应用基础上进一步改善了各种心脏功能,但这种保护作用取得的机理尚不十分清楚,实验中发现：冠状静脉窦流出液中的处理组腺苷水平较对照组明显升高,cGMP水平在L-NAME组明显升高,L-NAME组的心肌保护作用最强。本课题拟深入研究药物L-NAME预处理诱导第二窗的心肌保护作用机制,有望对心肌缺血／再灌注损伤的防治提供新的理论和方法,更好地在手术中保护心肌功能。目的1.药物L-NAME预处理诱导出的第二窗心肌保护作用,是否可叠加在冷停跳液提供的保护作用上再增强其保护作用。2.在药物L-NAME预处理诱导的第二窗心肌保护启动前给予腺苷A1受体拮抗剂DPCPX,探讨其对第二窗心肌保护作用的影响,明确腺苷受体激活是否为药物预处理后心肌保护的启动因子。材料和方法1.将体重250-320克30只雄性SD大鼠分成3组,每组10只：(1)缺血对照组：腹腔注射1ml生理盐水,24h后建立离体大鼠心脏Langendorff灌注模型；(2)L-NAME预处理组：腹腔内注射L-NAME (10mg/kg),24h后建立离体大鼠心脏Langendorff灌注模型；(3)拮抗剂组：腹腔注射DPCPX (0.1mg/kg),30min后注射L-NAME (10mg/kg),24h后建立离体大鼠心脏Langendorff灌注模型。2.大鼠称重后,给予戊巴比妥钠(60mg/kg)经腹腔注射麻醉,肝素(1000U／kg)经舌下静脉注射进行抗凝,快速开胸取出心脏,立即将心脏放入4℃K-H液中,插入主动脉插管,迅速移至Langendorff灌注装置上,用37℃K-H液(用95%O2和5%CO2持续平衡)灌注,灌注压维持在100cmH2O。肺动脉根部切开,使冠状动脉回流液引流充分。灌注1min后切开左心耳,经左心房、二尖瓣,将带有测压导管的心室球囊送入左心室,测压导管的另一端接压力换能器并与Pc-labue生物医学信号采集处理系统相连接。向心室球囊内缓慢注射适量蒸馏水,使左室舒张末压(LVEDP)维持在10mmHg。K-H液灌注稳定15min后,经主动脉根部灌注10ml 4℃St Thomas’Ⅱ停跳液,所有的心脏于20℃停跳60min(模拟手术中心脏停跳过程),而后再用K-H液灌注120min。在稳定末期只有满足下列条件：HR 240-360 beats/min, LVDP 60-130mmHg, CF 8-16 ml/min才纳入实验。3.实验中于灌注稳定15min、再灌注1min、再灌注60min、再灌注120min四个时间点用Pc-labue生物医学信号采集处理系统记录HR、LVDP,通过冠脉流出量及时间计算CF,同时收集冠脉流出液放于-20℃冰箱,备Siemens全自动化学发光免疫分析仪检测cTnI。实验结束时取左心室游离壁心肌用电镜固定液处理后在PHILIPS CM 10透射电镜下观察心肌超微结构变化。结果1.血流动力学：全组心率(HR)缺血前无差别,拮抗剂组缺血后心率较L-NAME组慢,有显著性差异(P<0.05),与缺血对照组无差别；左室发展压(LVDP)是心肌收缩压与舒张压之差,反映心肌的舒缩功能,拮抗剂组的LVDP较L-NAME预处理组低,有显著性差异(P<0.05),与缺血对照组无差别；冠脉流量(CF)反映冠脉血管阻力和心肌氧供情况,拮抗剂组的CF较L-NAME预处理组少,有显著性差异(P<0.05),与缺血对照组无差别。2.心肌酶：cTnI具有心肌特异性,对心肌损伤比其他心肌酶具有更高的敏感性和特异性,拮抗剂组的cTnI较L-NAME预处理组显著增高(P<0.05),与缺血对照组无差别。3.心肌超微结构改变：电镜下缺血对照组及拮抗剂组心肌细胞水肿明显,胞核不规则,染色体边集,线粒体肿胀,部分嵴模糊、空泡变,肌丝溶解,肌浆网扩张；L-NAME预处理组心肌细胞及间质轻度水肿,肌质纤维排列较整齐,肌丝清晰,线粒体轻度肿胀,部分嵴稍模糊,核染色体均匀。拮抗剂组及缺血对照组心肌超微结构的损伤程度较L-NAME预处理组重。结论1.药物L-NAME诱导出的第二窗心肌保护作用,可叠加在原有心肌保护液提供的保护作用之上再增强其保护作用。2.腺苷A1受体拮抗剂DPCPX阻断了L-NAME预处理诱导的第二窗心肌保护作用,腺苷A1受体可能是L-NAME预处理引起第二窗心肌保护作用的启动因子。