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一、研究背景目前,随着发病率和死亡率的不断增加,癌症已经成为中国疾病致死的首要因素。最新的统计数据显示,2015年中国有超过429.2万新诊断的癌症患者,超过281.4万人因癌症致死。肺癌是我国乃至全球最常见的恶性肿瘤,其总发病率和死亡率逐年上升,均居于恶性肿瘤第一位。放射治疗是目前肺癌的主要治疗手段之一。然而,非小细胞肺癌（NSCLC）尤其是肺腺癌细胞对放射线抗拒,导致肺癌患者放疗后效果不佳。近年来,越来越多的研究证实,肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）是肿瘤放射抗拒的根源。因此,从肿瘤干细胞层面探索其放疗抗拒的机制,为靶向杀伤肿瘤干细胞提供实验依据,是未来基因-放射治疗的新途径。微小RNA（microRNA,miRNA）作为一种非编码的RNA分子,参与了肿瘤的发生发展过程,发挥着促癌或抑癌的作用。并且,一些miRNAs参与调控肿瘤干细胞的部分生物学功能,如肿瘤千细胞的自我更新、多向分化及放化疗抵抗性等。本课题组前期研究发现,miR-18a在CD133+肺腺癌干细胞样细胞中低表达,而miR-18a可提高普通肺腺癌细胞（A549）的放射敏感性。那么,miR-18a能否调控肺腺癌干细胞样细胞放射敏感性呢,能否作为放射线靶向靶伤肺腺癌干细胞的分子靶点呢?本项目拟从miR-18a入手,探索其在CD133+肺腺癌干细胞样细胞中表达高低与CD133+肺腺癌干细胞样细胞放射敏感性之间的关系。二、研究目的探讨miR-18a在肺腺癌干细胞样细胞放射线抗拒中的作用及其调控机制,探索miR-18a作为增敏放射线靶向杀伤肿瘤干细胞的分子靶点的可能性。三、研究方法1、利用紫杉醇及无血清千细胞培养基,诱导肺腺癌A549细胞的成球生长,获得肺腺癌干细胞样细胞,流式细胞仪分选出CD133+细胞继续培养;利用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）、成球实验、克隆形成实验等对CD133+细胞进行干细胞相关特性验证;利用放射线照射CD133+及CD133-细胞,克隆形成实验检测克隆形成能力;qRT-PCR检测CD133+及CD133-细胞中miR-18a表达水平;构建miR-18a慢病毒（Lentivirus,LV）过表达体系,并转染CD133+细胞,分为miR-18a慢病毒转染组（miR-18a-LV）、空载体转染组（EV）及空白对照组（Blank）,qRT-PCR检测转染后细胞干性相关基因表达情况以及miR-18a表达情况,并检验转染后细胞成球能力;传代培养,获得稳定传代的miR-18a过表达CD133+细胞,不同剂量放射线照射转染前后细胞,分为miR-18a-LV组、EV组及Blank组,进行克隆形成实验,计算克隆形成数目及存活分数,描计细胞存活曲线并计算D0、Dq、SF2等放射生物学参数。2、利用网络资源在线分析软件,PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar）,TargetScan（http://www.targetscan.org/vert50/）和miRanda（http://www.microrna.org/）等预测miR-18a的靶基因（乏氧诱导因子1,HIF-1α）;运用双荧光素酶系统、qRT-PCR、Westen Blot等实验,验证miR-18a对HIF-1α的负调控作用;利用慢病毒载体建立miR-18a过表达A549细胞系,裸鼠移植瘤实验,验证miR-18a增强放射线对移植瘤的杀伤效应;qRT-PCR、Western blot检测移植瘤组织miR-18a、HIF-1α表达情况。3、收集NSCLC患者放疗前血浆样本,qRT-PCR检测患者放疗前血浆中miR-18a表达情况,以Cel-39为外参照,分析miR-18a表达高低与患者放疗疗效之间的相关性,并通过ROC曲线计算miR-18a最佳分界值（cut-off）;以miR-18a分界值为标准,分析miR-18a不同表达水平两组NSCLC患者在放疗反应性即客观缓解率（ORR）、无进展生存期（PFS）、总生存时间（OS）的差异,并计算miR-18a分界值预测放疗疗效的敏感性、特异性。四、研究结果1、无血清培养基成功诱导了克隆形成的肺腺癌细胞,流式细胞分选后获得了CD133+的细胞群,千性相关实验验证显示其具有干细胞特征;克隆形成实验显示CD133+细胞克隆形成能力高于CD133-细胞（P<0.05）;qRT-PCR实验显示CD133+细胞中miR-18a表达水平低于CD133-细胞（P<0.05）;通过慢病毒表达体系,获得了 miR-18a稳定过表达的CD133+细胞;放射线存活曲线显示,miR-18a过表达可增强CD133+细胞放射线敏感性,D0、Dq、SF2等放射生物学参数均下降（P<0.05）。2、双荧光素酶实验显示miR-18a与HIF-1α基因3’-UTR相结合,发挥直接调控作用;Westen Blot实验结果显示,miR-18a过表达,可阻断A549细胞中HIF-1α蛋白表达量（P<0.05）;放射线照射可下调A549细胞miR-18a表达水平,同时上调HIF-1α基因和蛋白表达;裸鼠移植瘤实验显示,与对照组相比,miR-18a辐照组移植瘤的肿瘤体积小、生长速度慢（P<0.05）,移植瘤中miR-18a表达较高,HIF-1α基因和蛋白表达较低。3、54例NSCLC患者放疗前血浆标本,qRT-PCR检测显示:放疗有效组（CR+PR）血浆miR-18a水平显著高于放疗耐受组（SD+PD）组（P<0.05）;ROC曲线显示miR-18a/Cel-39 最佳分界值为 2.28;以 miR-18a/cel-39>2.28 为参考值,miR-18a 高表达组放疗后ORR优于miR-18a低表达组（87%vs6%,P<0.05）,中位PFS无统计学差异（8.1m vs 6.5m,P>0.05）,中位 OS 也无统计学差异（18.7m vs 15.5m,P>0.05）;以miR-18a/cel-39>2.28为参考值,预测放疗疗效的敏感性为87%、特异性为95%。五、结论1、CD133+干细胞样细胞具有放射抗拒效应,其低表达miR-18a,可能是其放射线抗拒的重要机制之一。2、miR-18a过表达可增强CD133+干细胞样细胞对放射线的敏感性。3、HIF-1α是miR-18a的靶基因,miR-18a下调HIF-1α,是miR-18a增强肺腺癌干细胞样细胞对放射线的敏感性的分子机制。4、血浆miR-18a可作为预测NSCLC患者放疗敏感性的生物标志物。