细胞内的神经元纤维缠结(NFTs)是老年性痴呆(AD)的两个典型病理改变之一，NTFs的主要成分是异常过度磷酸化的微管相关蛋白Tau。本实验室研究的终目标是建立含P301L突变的tau转基因小鼠模型，研究Tau在AD等神经退行性疾病发病机制中的作用，探索tau与胞内蛋白降解重要通路——泛素—蛋白酶体系统(UPS)的关系，开发和筛选以Tau为靶点的治疗药物。 本实验室的前期研究，是将带有小鼠特异性的神经元启动子Thy-1和人的含P301L突变tau基因，通过雄原核显微注射法构建转基因小鼠并传至第四代。检测转基因阳性小鼠脑内有外源性tau的表达；海马及皮层部位具有NFTs的改变；并且具备行为学改变的趋势，但样本数太少。 本课题是在以上实验的基础上，继续探讨含P301L突变的tau转基因鼠的行为学改变及传代建系；并在转基因鼠上研究UPS。还在SH—SY5Y细胞株上研究烟碱和胆碱受体拮抗药对泛素的影响。 Morris水迷宫结果显示，3月龄转基因阳性鼠开始出现行为学改变趋势，6月龄阳性鼠的逃逸潜伏期明显长于阴性鼠，在第2、4、5天具有统计学差异；9、12月龄阳性鼠的逃逸潜伏期在第2、3、4、5天均长于阴性鼠，具有统计学差异。空间搜索实验中，6、9、12、15月龄阳性鼠的平台穿越次数均多于阴性鼠，具有统计学差异。结果表明，含P301L突变的tau转基因小鼠具有学习记忆障碍。 传代结果显示，种内繁殖群F1～F5代的携带外源性基因的阳性率(％)分别为48.33、45.31、64.1、69.86、63.16，而种间繁殖群F1～F5代的阳性率(％)分别为50、51.35、77.94、87.91、86.36，两种传代方式的阳性率间具有统计学差异；种内繁殖和种间繁殖群的平均离乳率分别为86.8％和100％，有统计学差异。可见，种间繁殖的阳性率及离乳率均高于种内繁殖。结果提示，含P301L突变的tau转基因小鼠适合采用种间繁殖的方式传代保种。 Western blot结果显示，外源性Tau蛋白只在阳性鼠各脑组织分区特异表达；泛素在阳性小鼠海马和前额叶皮层的相对灰度为1319±0.186、1.469±0.131，阴性鼠为1.000±0.075、1.000±0.147，阳性鼠海马和前额叶皮层的泛素表达增高与阴性鼠相比具有统计学差异；而颞叶和项叶皮层的泛素表达在阴性与阳性鼠间无差异。酶解荧光底物测定蛋白酶体活性结果显示，糜蛋白酶样活性与胰蛋白酶样活性在阳性鼠海马、糜蛋白酶样活性与酸中毒样水解酶活性在阳性鼠前额叶皮层均较阴性鼠低。推测在与学习记忆密切相关的海马和前额叶皮层，异常Tau蛋白表达促使机体动员更多的泛素进行底物泛素化，以促进其消除。但异常的Tau本身可以抑制蛋白酶体活性，阻碍异常Tau蛋白的降解，从而导致神经原纤维缠结的出现以及神经元死亡的发生。 前期实验显示：烟碱可诱导SH—SY5Y细胞泛素表达上调，并拮抗凋亡。本课题在此基础上，研究三种胆碱能受体拮抗剂对烟碱诱导泛素上调的影响。Western blot结果发现，α—银环蛇毒素及美加明都可以浓度依赖的抑制烟碱诱导的泛素上调作用，而阿托品无此作用。提示烟碱是通过激活α7型及含β2、β4亚基的胆碱能受体上调泛素的。 综上所述，本课题更进一步证实，所建立的含P301L突变的tau转基因小鼠脑内各区均有Tau的表达，以及学习记忆障碍。而且，发现6月龄转基因小鼠海马及前额叶皮层的泛素表达增加而蛋白酶体活性抑制。体外实验发现，烟碱是通过激活α7型及含β2、β4亚基的胆碱能受体上调泛素，具体机制有待进一步研究。