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目的:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症为主要特征的高度致残性自身免性疫病。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)是机体炎性反应链的启动蛋白,可通过与相应的配体结合,触发髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,My D88)依赖性或非依赖性途径,活化核因子κB(Nuclear factor-Kappa B,NF-κB),导致TNF-α、IL-1β等炎性细胞因子的激活,诱发局部炎症。TLRs信号通路,尤其是TLR4/My D88/NF-κB信号通路在RA发病中有重要作用。青藤碱(Sinomenine,SN)作为传统中药青风藤的有效提取物,在RA中的治疗作用受到越来越广泛的认可,本实验通过观察SN对RA患者外周血单核细胞TLR4/My D88/NF-κB信号通路的影响,探讨青藤碱对RA的作用机制。方法:1.本实验选取30例RA患者为研究对象,采集患者相关临床资料,检测C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)及血沉(Erythrocyte sedimentation rat,ESR)等,并进行DAS28评分。按照DAS28评分分为活动期17例,缓解期13例;同时选取10例健康志愿者作为健康对照组。体外分离外周血血浆,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆中细胞因子TNF-α、IL-1β的表达。2.选取上述活动期RA患者及健康志愿者的外周血进行单核细胞的分离培养:通过密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),置于37℃,5%CO2培养箱孵育4 h,弃上清,用37℃预热PBS轻洗2遍,获得贴壁的单核细胞,RPMI-1640完全培养基重悬细胞接种于24孔培养板,活动期RA患者单核细胞分为下列五组:(1)空白组:不给予任何药物干预;(2)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组:给予终浓度为100 ng/ml LPS干预;(3)低剂量SN组:给予终浓度为100 ng/ml LPS及200μmol/L SN干预;(4)高剂量SN组:给予终浓度为100 ng/ml LPS及1000μmol/L SN干预;(5)TAK-242组:给予终浓度为100 ng/ml LPS及1000 pg/ml TAK-242干预。置于37℃5%CO2培养箱中培养24 h后收获细胞及上清液。其中,健康志愿者外周血单核细胞作为健康对照组,不给予任何干预。3.检测SN对RA患者外周血单核细胞TLR4、My D88、NF-κB(P65)的影响:(1)流式细胞术(Flow Cyto Metry,FCM)检测CD14+单核细胞表面TLR4的阳性表达率;(2)实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,FQ RT-PCR)检测单核细胞TLR4、My D88、NF-κB(P65)m RNA的表达;(3)蛋白质印迹法(Western Blot)检测单核细胞TLR4、My D88、NF-κB(P65)蛋白的表达;(4)ELISA检测单核细胞培养上清中TNF-α的表达。结果:1.RA患者血浆中TNF-α、IL-1β的表达及与ESR、CRP及DAS28的相关性:RA活动期患者血浆TNF-α、IL-1β水平较健康对照组及RA缓解期明显增高,差异有统计学意义(均P<0.001);RA活动期患者ESR、CRP、DAS28水平较缓解期明显升高(P<0.05);RA患者血浆中TNF-α及IL-1β水平与ESR、CRP、DAS28呈正相关性(P<0.05)。2.流式细胞术检测青藤碱对RA患者外周血CD14+单核细胞表面TLR4阳性率的影响:RA活动期患者外周血CD14+单核细胞表面TLR4阳性率较健康对照组明显升高(P<0.05);RA活动期患者外周血CD14+单核细胞表面TLR4阳性率LPS组较空白组明显升高(P<0.05);RA活动期患者外周血CD14+单核细胞表面TLR4阳性率低剂量SN组、高剂量SN组、TAK-242组较LPS组均明显降低(均P<0.01),高剂量SN组较低剂量SN组明显降低(P<0.001)。3.青藤碱对RA患者外周血单核细胞TLR4、My D88、NF-κB(P65)m RNA表达的影响:RA活动期患者外周血单核细胞TLR4、My D88、NF-κB(P65)m RNA表达较健康对照组明显升高(均P<0.001);RA活动期患者外周血单核细胞TLR4、My D88、NF-κB(P65)m RNA表达LPS组较空白组明显升高(均P<0.001);RA活动期患者外周血单核细胞TLR4、NF-κB(P65)m RNA表达低剂量SN组、高剂量SN组、TAK-242组较LPS组均明显降低(P<0.01,P<0.001,P<0.001);RA活动期患者外周血单核细胞My D88 m RNA表达低剂量SN组、高剂量SN组、TAK-242组较LPS组均明显降低(P<0.01,P<0.001,P<0.01)。4.青藤碱对RA患者外周血单核细胞TLR4、My D88、NF-κB(P65)蛋白表达的影响:RA活动期单核细胞TLR4、My D88、NF-κB(P65)蛋白表达较健康对照组明显升高(均P<0.001);TLR4、My D88、NF-κB(P65)蛋白表达LPS组较空白组明显升高(均P<0.001);RA活动期患者外周血单核细胞TLR4蛋白表达低剂量SN组、高剂量SN组、TAK-242组较LPS组均明显降低(均P<0.001),高剂量SN组较低剂量SN组明显降低(P<0.001)。5.青藤碱对RA患者外周血单核细胞培养上清液中TNF-α表达的影响:RA活动期患者单核细胞培养上清液中TNF-α表达较健康对照组明显升高(P<0.05);RA活动期外周血单核细胞培养上清液中TNF-α表达LPS组较空白组明显升高(P<0.05);RA活动期外周血单核细胞培养上清液中TNF-α表达低剂量SN组、高剂量SN组、TAK-242组较LPS组均明显降低(均P<0.01),高剂量SN组较低剂量SN组明显降低(P<0.001)。结论:1.活动期RA患者血浆中TNF-α、IL-1β水平明显上升,外周血单核细胞中TLR4、My D88、NF-κB(P65)表达明显升高,单核细胞培养上清中TNF-α分泌明显增多。活动期RA患者可能存在TLR4/My D88/NF-κB信号通路的激活。2.SN可抑制RA患者外周血单核细胞TLR、My D88、NF-κB(P65)及TNF-α的表达,其对RA的治疗作用可能与其抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路表达有关。