生物体自身及外界环境处于不断的变化之中,代谢调控使得生物体能对自身及外界信号产生反馈并与其周围环境进行互动。在这个过程中,蛋白质作为生命的体现者,同时也是生物体代谢调控的重要参与者。在蛋白质结构与功能关系的研究中,深入理解蛋白质的动态行为原理对蛋白质功能多样性的认识以及新功能蛋白的设计有着重要的意义。随着理论的不断完善和方法的快速发展,分子模拟在物理、化学、生命科学等诸多领域发挥着越来越重要的作用,已成为实验研究难以替代的手段。本论文旨在研究代谢调控中与分子识别和信号传导相关的动态行为原理,内容上由两部分构成：第一部分包括第二章和第三章,该部分以1,3-丙二醇的生物合成为工程背景,以调控过程的分子识别为动态模型,以1,3-丙二醇的氧化还原反应为研究对象,揭示了1,3-丙二醇氧化还原酶和非特异性醛还原酶对辅酶Ⅰ/Ⅱ的特异性识别机理,并完成了1,3-丙二醇氧化还原酶辅酶结合特异性的设计与改造；第二部分由第四章、第五章和第六章构成,该部分以L-赖氨酸的生物合成为工程背景,以调控过程的信号传导为动态模型,以天门冬氨酸激酶为研究对象,给出了可揭示变构调节过程动态行为特征的能量耗散模拟方法,并基于能量耗散模拟给出了构建分子内信号传导网络的新方法,以及该方法在多聚体蛋白亚基间信号传导分析中的应用。在第二章Klebsiella pneumoniae1,3-丙二醇氧化还原酶辅酶结合特异性的设计与改造中,首先采用同源模建的方法得到1,3-丙二醇氧化还原酶的三维结构,然后对1,3-丙二醇氧化还原酶与辅酶结合的过程进行分子动力学模拟和结合自由能计算。计算结果表明,静电相互作用对辅酶的结合起到主要作用。丙氨酸突变扫描显示,Asp41是决定辅酶特异性的唯一关键氨基酸残基,Asp41的侧链与辅酶Ⅱ之间存在较强的空间位阻和静电排斥作用。以Kpneumoniae基因组为模板扩增出编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT,酶切后连接到载体pET23a(+),以该重组载体为模板进行引物重叠延伸定点突变。将原始载体和突变后的重组载体在E. coli DH5α中克隆,以E. coli BL21(DE3)为表达宿主进行高效表达。表达产物纯化后得到了电泳级纯度的原始酶和突变酶。酶活测定的结果表明,突变酶以辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ为辅酶时的比酶活分别为629.38U mg-1和277.35Umg-1,而原始酶分别为706.90U mg-1和20.95U mg-1。结合酶动力学参数可知,改造后的1,3-丙二醇氧化还原酶可以既能够利用辅酶Ⅰ,又能够利用辅酶Ⅱ。在第三章Klebsiella pneumoniae非特异性醛还原酶对辅酶Ⅰ/Ⅱ识别的研究中,首先以K. pneumoniae基因组为模板扩增得到醛还原酶的基因,酶切后连接到载体pET23a(+),将重组载体在E. coli DH5α中克隆,并以E. coli BL21(DE3)为表达宿主进行高效表达。表达产物纯化后得到了电泳级纯度的酶。对纯化后的酶进行活性测定,结果显示：在催化还原反应时,该酶表现出非特异性；而在氧化反应中则无催化活性。且辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ均可参与还原反应的进行,但对辅酶Ⅱ表现出较强的结合特性。采用同源模建和分子动力学模拟的方法对该酶的辅酶结合机制进行了研究。氢键分析的结果显示,该醛还原酶与辅酶Ⅱ之间形成的氢键相互作用远强于与辅酶Ⅰ之间的氢键相互作用。结合自由能分解的结果表明,与不同辅酶结合时自由能的差异主要是由残基链Gly37-Val41与辅酶之间的静电相互作用和极性溶剂化相互作用的变化引起的。在同1,3-丙二醇氧化还原酶辅酶结合特异性的比较中发现,与辅酶Ⅱ腺嘌呤核糖上2’位羟基相连的磷酸基团附近的Gly38是决定新型醛还原酶辅酶结合特异性的关键氨基酸残基。蛋白质的动态行为是其功能的基础,尤其表现在与变构调节相关的生物学过程中。为了揭示蛋白质变构调节过程的动态行为特征,论文第四章以E. coli中L-赖氨酸生物合成途径的一个关键酶—天门冬氨酸激酶Ⅲ作为动态模型,对其进行能量耗散动力学模拟。计算结果显示,在能量耗散的过程中,受能量扰动的氨基酸残基数目随耗散时间表现为双曲线形式。采用双态Boltzmann方程对该过程进行定量描述,并由此定义了可表征能量耗散过程的两个参数—半数响应时间和耗散速率常数。同时,残基响应时间显示,在E. coli天门冬氨酸激酶Ⅲ的变构调节过程中,除了ACT2结构域的信号传导途径之外,在调节位点与催化位点之间还存在着另外一条途径,即ACT1结构域中的β15-αK环途径。此外,在残基响应时间的基础上,引入了蛋白质动力学模块的概念。与蛋白质结构模块的概念不同,蛋白质动力学模块可以从蛋白质的动态行为的角度揭示其行为特征及其与蛋白质功能之间的关系。在对E. coli天门冬氨酸激酶Ⅲ突变酶的研究中,能量耗散模拟揭示了突变位点对变构调节过程动态行为的影响机制。在能量耗散模拟的基础上,论文第五章给出了一个构建分子内信号传导网络的新方法。该方法通过将变构调节过程的动态信息(信号传导的方向信息)引入蛋白质残基相互作用网络而得到信号传导网络。在以E. coli天门冬氨酸激酶Ⅲ为动态模型的研究中,所构建的信号传导网络表现出某些明显的偏好性,如结构域,二级结构类型以及氨基酸残基的保守性等。网络超级节点中枢的发现表明,变构调节倾向于将具有较高连接度的氨基酸残基聚集起来共同实现信号的传导过程。此外,为了衡量氨基酸残基在信号传导网络中的传导能力,定义了一个新的网络参数一传导系数。同网络分析中节点度的概念相比,该网络参数可以更加准确地反映有向网络中节点的信息传递能力。通过与已有的实验结果进行比较,该方法表现出较强的变构调节功能位点的预测能力,能够预测出所有可以减弱或消除变构调节活性的功能位点。蛋白质亚基间的动态相互作用是许多生物系统代谢调控的基础,揭示亚基间相互作用的机理以及亚基间相互作用与蛋白质动态行为之间的关系是生物学领域的重要课题。因此,在上述工作的基础上,本论文最后一章以来自Corynebacterium glutamicum的异源多聚体变构蛋白—天门冬氨酸激酶作为动态模型,来揭示与亚基间相互作用及变构调节相关的的信号传导过程,尤其是亚基间信号传导的分析。为此,分别对各亚基和整个蛋白质进行了能量耗散模拟及信号传导网络的构建。研究显示,效应分子苏氨酸并不对变构调节过程做出贡献,而只是参与亚基间的相互结合。在变构调节的过程中,信号由赖氨酸结合位点传导至催化位点的方式既可以通过直接的亚基间信号传导的方式,又可以通过间接的方式：即先通过亚基间信号传导的方式将信号传导至α-亚基的调节结构域,再通过亚基内信号传导的方式传导至催化结构域,进而影响催化位点的活性。同时,通过与已有的实验结果的比较,该方法同样能够预测出所有可以减弱或消除变构调节活性的功能位点,进一步表明了该方法应用的普遍性。综上所述,本论文以1,3-丙二醇生物合成中辅酶Ⅰ/Ⅱ的分子识别和L-赖氨酸生物合成中天门冬氨酸激酶的分子内信号传导为研究实例,展示了蛋白质的动态行为在代谢调控中的作用机制,为蛋白质分子工程在代谢调控领域的深入开展提供了理论基础与方法实例。