HIV感染可通过多种机制引起机体内T细胞凋亡,其中,病毒的编码蛋白可以根据其在靶细胞内的表达水平调节细胞凋亡。gp120蛋白作为HIV包膜蛋白的主要组成部分,既可以在细胞外与细胞表面的CD4分子结合导致靶细胞和旁观者细胞凋亡,又可以在细胞内上调Fas、FasL、TNF-α、TRAIL受体DR4和DR5的表达诱导细胞凋亡,还可以使细胞滞留在G2期导致胞内ROS升高促进凋亡。研究显示,CD45分子在HIV-1 gp120蛋白介导的CD4+T细胞凋亡中发挥调节作用,在gp120蛋白的作用下,CD45分子通过调节FasL的表达参与细胞凋亡。作为I型跨膜糖蛋白,CD45分子主要以CD45RABC、CD45RO、CD45RA、CD45RB和CD45RC等异构体形式表达于淋巴细胞,其胞外结构域糖基化形式的差异对CD45异构体活性和功能具有重要影响。目前,CD45异构体在HIV感染引起的细胞凋亡方面研究甚少,为加深对CD45异构体在细胞凋亡过程中作用的理解,本研究通过构建稳定表达CD45异构体的细胞系,比较了CD45异构体在调节gp120蛋白介导的CD4+T细胞凋亡过程中的差异,并进一步分析了其下游分子Lck的活性变化。在本研究中,我们首先比较了CD45+的Jurkat细胞和CD45-的J45.01细胞受到gp120诱导时凋亡率的变化。结果显示,Jurkat细胞可发生明显凋亡现象,J45.01细胞不发生凋亡,说明CD45分子在gp120介导的凋亡过程发挥了调节作用;随后,我们构建了5种稳定表达CD45异构体的细胞系,并比较了这5种异构体在gp120介导T细胞凋亡过程中的作用。结果发现,CD45RO可以明显调节细胞凋亡,其他异构体对细胞凋亡无调节作用;接下来,我们分析了CD45的糖基化形式对细胞凋亡的影响。O-聚糖存在于除CD45RO以外的异构体上,我们通过O-糖基化抑制剂去除这几种异构体细胞表面的O-糖基化。gp120蛋白诱导凋亡处理后,去除O-糖基化后的CD45RA-J45.01细胞表现出凋亡特性,其它异构体细胞未发生明显凋亡。说明O-聚糖对HIV-1 gp120蛋白介导的细胞凋亡有一定的抑制作用,但在各异构体中发挥的作用大小并不一致,这可能与CD45异构体的空间结构有关。为了进一步说明CD45异构体在调节细胞凋亡中的功能差异,在HIV-1 gp120蛋白诱导各个细胞系后,我们分析了 CD45异构体酪氨酸磷酸酶的活性变化。通过比较CD45对其底物Lck的活性抑制位点Tyr505的去磷酸化程度,发现CD45RO可使Lck Tyr505发生明显的去磷酸化,说明HIV-1 gp120蛋白处理细胞后,CD45RO的活性增强;Lck Tyr394是Lck的活化位点,该位点磷酸化程度增强代表Lck活性增强。通过比较该位点磷酸化程度变化,发现在CD45RO-J45.01细胞中Lck Tyr394磷酸化程度增强,说明在HIV-1 gp120蛋白处理细胞后CD45RO促进了 Lck的活化;Lck的活化在胞内信号转导中具有重要作用,于是我们利用Lck的特异性抑制剂PP2处理CD45RO-J45.01细胞和Jurkat细胞,再经HIV-1 gp120蛋白诱导凋亡处理,发现PP2可抑制CD45RO-J45.01细胞和Jurkat细胞凋亡,说明Lck的活化参与HIV-1 gp120蛋白介导的T细胞凋亡。综上所述,本研究明确了 CD45异构体在调节HIV-1 gp120蛋白介导的T细胞凋亡中存在的差异,揭示了这一凋亡过程主要是CD45RO通过活化Lck促使凋亡信号向胞内传导,进而对细胞凋亡起调节作用。本研究结果为HIV-1感染引起的旁观者细胞凋亡奠定了理论基础。SIV恒河猴感染模型是当前研究AIDS的理想模型,在艾滋病发病机理、传播途径、免疫反应、疫苗开发以及药物治疗等方面具有重要作用。为了能够直观的观察病毒在动物模型体内的感染和分布情况,我们构建了一株携带绿色荧光蛋白的SIV毒株。在本研究中,首先从pEGFP质粒中获得绿色荧光蛋白(GFP)基因片段,随后将该片段插入到已引入适当酶切位点的p239PSE3’质粒中,GFP的插入使Nef表达缺失,经进一步的Sphl酶切后,将带有GFP的p239SpE3’质粒与p239SpSp5’质粒进行连接,获得完整的、带有GFP基因的SIVmac239DNA感染性克隆。该感染性克隆经转染293 T细胞,包装出的病毒感染CEM×174细胞,镜下可见细胞中有绿色荧光蛋白表达,说明毒株构建成功。然而构建携带GFP的SIV病毒株感染性不强,需要进一步的修饰和传代来提高病毒的感染性。