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研究背景:随着人们生活水平的不断提高,乳腺癌发病率呈上升趋势,世界银行及世界卫生组织全球疾病负担报告所示:2002年乳腺癌在全球所造成的损失约614万伤残调整寿命年(Disability adjust Life years, DALYs),居女性恶性肿瘤疾病负担的首位,控制乳腺癌被认为是降低全球癌症负担的最有效的措施之一。中医药作为综合治疗的重要组成部分,有一定的疗效和独特的优势,但是长期以来,中医药在乳腺癌综合治疗中的地位不高,探讨中医药防治乳腺癌在综合治疗中的切入点和时机,运用分子生物学方法研究中医药防治乳腺癌机理,一直是我国乳腺癌研究的重要课题。番荔枝被称为“明日抗癌之星”,近年来国内外在番荔枝抗肿瘤的研究方面,取得了一定的进展,番荔枝内酯化合物被认为是继紫杉醇后的又一个有前途的、天然来源的抗肿瘤化合物,从番荔枝中分离出的抗癌活性最强的内酯为Bullatacin,研究表明:Bullatacin在小鼠体内活性比紫杉醇强400-600倍,本课题从番荔枝种子的醇浸膏中,分离出Bullatacin,研究其对人乳腺癌细胞的作用及其作用机理,为抗乳腺癌的中药新药开发提供理论和实验依据,进一步为中西结合治疗乳腺癌奠定理论基础。研究目的:1、阐明癌毒是乳腺癌发生发展的关键因素,规范化和个体化,辨病论治和辨证论治矛盾统一,为中西结合治疗乳腺癌的方向和思路提供一定的理论依据;2、从番荔枝种子的醇浸膏中,筛选出抗癌活性最强的番荔枝内酯单体Bullatacin,研究其对人乳腺癌细胞的作用及其作用机理,为抗乳腺癌的中药新药开发提供理论和实验依据。研究方法:采用文献研究和现代实验研究相结合的方法。1、文献研究:1)对乳腺癌的古代与现代中医药文献进行研究,找寻出乳腺癌发生发展的关键因素,并对其进行阐发;2)用循证医学的观点和方法,对现代医学关于乳腺癌的理论与临床实践进行一定的梳理,寻找中西结合诊治乳腺癌的切入点和时机。2、实验研究:2.1、番荔枝内酯单体Bullatacin的提取:番荔枝种子粉碎,95%乙醇冷浸,回流提取3次,依次用石油醚、水饱和氯仿、甲醇萃取,通过反复硅胶柱层析、重结晶等方法从氯仿部分,分得番荔枝内酯类化合物,通过反复硅胶柱层析和重结晶等方法,得到番荔枝总内酯部位和Bullatacin单体化合物。2.2、MTT法观察Bullatacin体外对ER(+)人乳腺癌细胞MCF-7和ER(-)人乳腺癌细胞MDA-MB-231的作用:采用MTT法,,测试受试样品Bullacatin体外对ER(+)的人乳腺癌细胞MCF-7和ER(-)人乳腺癌细胞MDA-MB-231有无抑制作用及作用强度,并筛选出各自的有效剂量和作用时间。2.3、观察Bullacatin对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞形态学的影响:倒置显微镜与透射电镜观察20ug/ml Bullacatin体外对ER(-)人乳腺癌细胞MDA-MB-231的形态学的影响。2.4、流式细胞仪检测Bullacatin对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞周期的影响:流式细胞仪分析,20ug/ml Bullacatin作用人乳腺癌细胞MDA-MB-231 0h、12h、24h、48h对细胞周期的影响2.5、Annexin V-FITC染色流式细胞术考察Bullacatin对人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响:Annexin V-FITC染色流式细胞仪检测凋亡,考察Bullacatin20ug/ml作用人乳腺癌细胞MDA-MB-231 48h对细胞凋亡的影响,分别加入MAPK通路激动剂与MAPK各主要通路的抑制剂后,观察药物对细胞凋亡的影响2.6、Western Blot检测Bullacatin对人乳腺癌细胞MDA-MB-231 MAPK通路的作用:Western Blotting检测Bullacatin 20ug/m作用人乳腺癌细胞MDA-MB-231 48h和分别加入MAPK通路激动剂与MAPK各主要通路的抑制剂后,不同实验组磷酸化与总蛋白的表达,观测Bullacatin对MAPK信号通路的作用。研究结果:1、癌毒贯穿乳腺癌发生与发展的始终,循证医学要求规范化和个体化,辨病论治和辩证论治的矛盾统一;2、从番荔枝种子氯仿部分,分得番荔枝内酯类化合物,通过反复硅胶柱层析和重结晶等方法,得到的化合物,根据理化常数和波谱学数据鉴定了结构,为Bullatacin,纯度大于95%;3、受试样品Bullacatin不管对ER(+)的MCF-7还是ER(-)MDA-MB-231细胞均有具有抑制作用,且有剂量和时间依赖性。20ug/ml的Bullacatin作用48小时,对于MDA-MB-231细胞的抑制率与紫杉醇组相比,没有差异;4、20ug/ml的Bullacatin作用于细胞后,G1期的细胞比率减少,S期的细胞比率增加,细胞周期明显阻滞在S期。且G1期细胞比率随着Bullacatin作用的时间延长而减少,S期细胞比率随着Bullacatin作用的时间延长增加,Bullacatin对细胞周期的影响具有时间依赖性。5、Bullacatin20ug/ml,作用于MDA-MB-231 48h细胞:1)普通倒置显微镜下见:细胞密度较空白组减低,增殖变慢,细胞逐渐变大、变圆,细胞间接触变松,胞浆中颗粒增多,空泡化,脱壁,细胞周围碎片增多;2)电镜显示:细胞表面微绒毛部分或全部脱失,胞质内细胞器明显扩张,以线粒体扩张明显,并有许多空泡形成,内质网扩张,细胞器有外渗现象,未见典型的凋亡和凋亡小体;3)Bullacatin20ug/ml作用于MDA-MB-231细胞48小时,流式细胞仪检测,Annexin V染色的细胞为27.1%与阴性对照组4.2%比较,有显著差异;MAPK通路的激动剂能够促进MDA-MB-231 Annexin V染色的细胞的出现,作用较Bullacatin弱,激动剂与Bullacatin有协同作用;分别加入MAPK的3条主要通路的抑制剂,三者虽然与药物组Annexin V染色的细胞27.1%比有所下降,与阴性对照组4.2%比较,仍有显著差异。6、Bullacatin20ug/ml,作用于MDA-MB-231细胞48小时Western Blotting检测发现:1)激活ERK通路,导致P-ERK的增强,增强作用大于激动剂对ERK的作用;2)激活JNK通路,导致P-ERK的增强,增强作用小于激动剂对ERK的作用;3)激活P38-MAPK通路,导致P-P38的表达增强,增强作用大于激动剂对P38通路的作用。4)JNK与ERK通路有协同作用;5)ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125亦能轻度抑制P38的磷酸化,P38抑制剂SB203580对Bullatacin激活P38通路有抑制作用,但不能完全抑制其表达研究结论:1、乳腺癌现代医学要求的规范化和个体化治疗,中医理论所倡导的同病异治、异病同治,一定程度上可以通过癌毒理论和靶向治疗理论实现;2、Bullatacin体外对人乳腺癌细胞MDA-MB-231具有较强的抑制作用,使G1期的细胞比率减少,S期的细胞比率增加,细胞周期明显阻滞在S期,这种抑制作用,同时有量效与时效关系;3、Bullatacin诱导了细胞程序性死亡中的副凋亡形式,机理可能与MAPK通路的上游激活有关。