论文部分内容阅读
远场光学显微成像技术具有无损、特异性强、穿透深度深等优点,是生物医学研究中的重要工具。然而,由于光学衍射极限的存在,远场光学显微成像技术的分辨率被限制在200nnm左右,无法满足现代生物医学研究的需求。共聚焦显微技术可以有效提高远场光学显微成像技术的分辨率,然而其分辨率依然受到光学衍射极限的限制。荧光显微成像技术具有高信噪比、特异性强、多参量等优点,特别适用于长时程生物样品的观测。荧光显微的“选择性标记,选择性激发”的成像特点,理论上可以突破衍射极限的限制。因此,基于荧光理论的超分辨显微术是远场光学超分辨显微技术中的代表性技术。然而,现有的超分辨技术仍存在很多问题,例如分辨率不够高、系统复杂、样品适用范围窄、成像速度慢等。本论文基于荧光能级理论与共聚焦技术,通过对荧光进行时空调控,旨在获取分辨率更高、系统更加简化、对荧光样品适用范围更广、更多元的光学超分辨显微方法和系统,实现荧光样品的亚百纳米分辨率成像。主要工作和创新点如下：(1) 提出了两种基于探测点扩散函数调制的超分辨方法和系统：通过对普通共聚焦系统进行简单的改造,以及对荧光的“虚拟空间调控”,基于探测点扩散函数调制的超分辨方法和系统具有分辨率高、实时成像、信噪比高、系统结构简单、样品适用范围广等优点。(2) 基于时间门控技术和基于受激辐射的荧光时空调控技术,提出了一种离线式时间门控STED超分辨系统；同时利用荧光寿命分布,创新性地提出了一种基于荧光寿命分布的光斑对准方法：本系统获得38nm-50nm的高分辨率,同时相对于普通STED,系统得到了大大的简化,所需受激辐射光强也大大减弱。(3) 设计并搭建了一套基于STED和FED双模式快速扫描超分辨显微系统：创造性地将STED和FED两类超分辨技术集成在同一套系统中,本系统具有样品适用范围广、成像速度快、分辨率高等特点,系统STED模式可以获得110nm左右分辨率,FED模式可以获取140nnm左右分辨率。(4) 研究了STED系统中抗漂白封片荆、颗粒样品、生物样品的相关制备方法,对于缓解STED方法中样品的漂白问题有重要意义。(5) 提出了一种共聚焦系统下基于荧光漂白与荧光随机定位超分辨方法：针对荧光显徽成像中的漂白问题,“变废为宝”。本方法采用普通的共聚焦结构,有非常高的应用意义。基于荧光漂白与荧光随机定位超分辨方法具有高分辨率、样品适用范围广、系统结构简单等优点。