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第一部分 工RAK-M在小鼠慢性哮喘气道高反应性和气道炎症及重塑中的作用目的哮喘是一种异质性疾病,其特征是持续性的慢性气道炎症,进而可导致气道高反应性、粘液高分泌和气道重塑。白介素-1受体相关激酶M (Interleukin-1 receptor-associated kinase M, IRAK-M)是一种丝/苏氨酸激酶,在炎症细胞因子IL-1诱导下能和IL-1受体相结合,可对钟样受体(Toll like receptor, TLR)信号传导进行调节,参与调控多种感染性及非感染性疾病。研究发现巨噬细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞等细胞均可表达IRAK-M,遗传学表明IRAK-M参与早发持续性哮喘的发病,并且哮喘患者气道粘膜有IRAK-M的高表达,但是IRAK-M对哮喘的具体作用及其机制尚未阐明。本实验通过建立小鼠慢性哮喘模型,对以下问题进行研究：(1)观察IRAK-M在慢性哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症及气道重塑中的作用。(2)探讨IRAK-M在哮喘发病作用中的机制。方法将无特定病原体(Specific pathogen free, SPF)级C57BL/6雌性小鼠(6-8周)随机分为四组：对照组1(Wild type/normal saline组,即WT/NS组)、对照组2(Knockout of IRAK-M gene/normal saline组,即KO/NS组)、哮喘组1(Wild type/ Oval bumin组,即WT/OVA组)、哮喘组2(Knockout of IRAK-M gene/Oval bumin组,即KO/OVA组)。按照致敏和激发阶段建立模型。对以下指标进行检测：(1)观察小鼠的一般情况;(2)予不同浓度乙酰甲胆碱进行气道激发后,采用气管插管有创肺阻抗方法测定小鼠的气道阻力：(3)进行支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)细胞计数及分类；(4)肺组织病理切片分别行HE染色、PAS染色、Masson染色观察炎症细胞浸润、粘液分泌、胶原沉积情况；(5)酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测BALF中炎症因子浓度；(6)Western blot万法检测肺组织中IRAK-M及炎症相关蛋白表达；(7)Real-time PCR方法检测肺组织中炎症因子的mRNA表达水平；(8)测定肺组织羟脯氨酸含量。使用SPSS 20.0和GraphPad Prism software 60进行统计分析和做图。结果(1)OVA组小鼠饮食、活动尚可,但碰触鼻部较NS组频繁,部分小鼠有易激惹表现。(2) WT/OVA组小鼠肺组织中IRAK-M在mRNA和蛋白水平表达较WT/NS组增加。(3) WT/OVA组小鼠气道反应性较WT/NS组增高,KO/OVA组小鼠气道反应性较WT/OVA组降低。(4)肺组织病理HE染色及PAS染色显示,相较于WT/NS组, WT/OVA组小鼠的肺组织伴有炎症细胞浸润增加、气道粘液分泌增加,KO/OVA组小鼠的肺组织炎症细胞浸润、气道粘液分泌较WT/OVA组减轻。(5)WT/OVA组小鼠BALF白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞较WT/NS组增高,KO/OVA组小鼠BALF白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞较WT/OVA组降低。(6)WT/OVA组小鼠肺组织中IL-4 mRNA、MUC5AC mRNA表达较WT/NS组增加,IFN-γ mRNA表达下降；KO/OVA组小鼠肺组织中IL-4 mRNA、MUC5AC mRNA表达较WT/OVA组下降,IFN-γ mRNA表达增加。WT/OVA组BALF中IL-4浓度较WT/NS组增高,IFN-γ浓度较WT/NS组降低;KO/OVA组BALF中IL-4浓度较WT/OVA组降低,IFN-γ浓度较WT/OVA组升高：WT/OVA组BALF中IL-13浓度较WT/NS组增高。(7)肺组织病理Masson染色显示,相较于WT/NS组,WT/OVA组小鼠肺组织胶原纤维沉积增加,KO/OVA组胶原纤维沉积较WT/OVA组减少。WT/OVA组小鼠肺组织羟脯氨酸含量较WT/NS组增多；KO/OVA组小鼠肺组织羟脯氨酸含量较WT/OVA组减少。WT/OVA组小鼠肺组织中TGF-β1 mRNA表达水平较WT/NS组升高,KO/OVA组小鼠肺组织中TGF-β1mRNA表达水平较WT/OVA组下降。WT/OVA组小鼠肺组织中α-SMA蛋白较WT/NS组表达增加,KO/OVA组小鼠肺组织中α-SMA蛋白较WT/OVA组表达减少。(8)WT/OVA组小鼠肺组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达较WT/NS组增加,KO/OVA组小鼠肺组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达较WT/OVA组降低。结论(1)小鼠慢性哮喘模型中,IRAK-M基因敲除可使气道高反应性、气道炎症及气道重塑减轻,IRAK-M参与了小鼠哮喘的发病。(2) IRAK-M可通过活化NF-κ B对哮喘炎症进行调节。第二部分 噻托溴铵治疗重度持续哮喘疗效及安全性Meta分析研究目的噻托溴铵(tiotropium)是一种长效抗胆碱药物,主要作用表现在扩张支气管。重度持续哮喘患者使用糖皮质激素及长效β2受体激动剂等药物治疗后仍控制欠’佳,在这些药物基础上使用噻托溴铵可以扩张支气管,改善气流受限。本文对有关噻托溴铵治疗重度持续哮喘的随机对照试验(Randomized controlled trial, RCT)进行了疗效和安全性方面的荟萃分析。研究方法计算机检索Cochrane Library、ClinicalTrials. gov、PubMed、Ovid Medline、中国期刊全文数据库(CNKI)、维普中文科技期刊全文数据(CSJD),检索时间自1946年01月至2015年02月,查找关于噻托溴铵治疗重度持续哮喘的随机对照试验;对于符合纳入标准、排除标准的RCT进行资料提取及质量评价；采用Revman5.3软件对纳入文献行进Meta分析。结果共纳入5项RCTs,包括1433名患者,结果显示,与安慰剂组相比,噻托溴铵组第1秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in one second, FEV1)峰值[加权均数差(Weighted mean difference,WMD)=0.13 L,95%置信区间(Confidence interval, CI) 0.10-0.16 L, P<0.00001]、FEV1谷值[WMD 0.09 L,95%CI 0.06-0.12L,P<0.00001]、用力肺活量(Forced vital capacity, FVC)峰值(WMD 0.10 L,95%CI 0.06-0.14 L, P<0.00001), FVC谷值(WMD 0.12 L,95%CI0.08-0.17 L,P<0.00001)、晨起呼气峰值流速(Peak expiratory flow, PEF)(WMD 9.21 L/min, 95%CI 4.2-14.23 L/min, P=0.0003)、夜间PEF(WMD 22.06 L/min,95%CI 13.05-31.08 L/min, P<0.00001)等均有改善,具有统计学差异(P<0.05)；哮喘控制问卷(Asthma control questionnaire, ACQ)评分(WMD 0.01,95% CI-0.07 to 0.09,P=0.86)及哮喘生活质量问卷调查(Asthma quality of life questionnaire, AQLQ)评分(WMD-0.06,95% CI-0.18 to 0.06, P=0.33)未见统计学差异(P>0.05)；噻托溴铵组与安慰剂组不良反应发生率未见统计学差异。结论在使用糖皮质激素和长效β2受体激动剂联合治疗的基础上,吸入噻托溴铵可改善重度持续哮喘患者的FEV1、FVC、PEF,并且耐受性良好,但对于生活质量无明显改善作用。