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目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)最常见的严重微血管并发症之一,是导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因。在糖尿病肾脏损伤的发生发展过程中炎症反应发挥了重要作用,TGF-β1/p38MAPK通路是机体最重要的炎症反应通路之一。TGF-β1能够激活p38MAPK的基因序列,使下游的核转录因子κB(nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)表达增加,阻断或抑制炎症反应,减缓肾脏纤维化已成为防治糖尿病肾病的关键。氢气是中性的、分子量小于氧气的分子,可轻易穿透生物膜,目前已被证明在器官损伤中能够抑制炎症反应和细胞凋亡。研究证实富氢液(hydrogen rich saline,HRS)和氢气同样具有抗氧化、抗炎等功效。有研究报道,富氢液还能够延缓糖尿病肾病的进展,但确切机制尚不十分明了。本课题拟通过建立链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型,给予富氢液(HRS)15ml/Kg进行干预,应用免疫组织化学、实时荧光定量PCR(realtime fluorescent quantitative PCR,RTFQ-PCR))等方法检测肾组织中TGF-β1、p-p38MAPK、NF-κB、MCP-1的表达情况,观察糖尿病大鼠肾脏炎症反应状态及富氢液的干预效果,探讨延缓肾损伤的发生发展机制,为人类糖尿病肾病的早期防治提供实验性理论依据。方法:选择36只健康雄性清洁级SD大鼠(购自河北医科大学动物中心),体重约200±20g,将上述大鼠随机分为3组:正常对照组(NC组,n=12)、糖尿病模型组(DM组,n=12)、糖尿病富氢液干预组(DM+HRS组,n=12)。适应性喂养1周后,禁食水12小时,DM组及DM+HRS组大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素65 mg/kg(溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液中,PH 4.3),若72h后尾静脉取血检测血糖≥16.7mmol/L,尿糖+++~++++,则认为造模成功,同时给予NC组一次性腹腔注射同等剂量的柠檬酸缓冲液。在整个实验过程中,所有大鼠均自由进食、进水,保持动物房湿度(40%~70%)及温度(20℃~26℃)相对恒定。DM+HRS组大鼠每日给予15ml/kg富氢液(浓度≥0.6mmol/L,即≥0.6 ppm)灌胃一次,NC组、DM组每天给予等量的生理盐水灌胃。在造模成功后第8周、12周末,各组分别任意选取6只大鼠,测定血糖、尿素氮、血肌酐及24小时尿蛋白定量(24 hours urinary protein,24 h UP)等生化指标,并收集大鼠肾脏组织标本,制备组织切片,行苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin stainin,HE)及糖原染色(periodic acid-schiff stain,PAS),光学显微镜下观察大鼠肾脏病理变化,免疫组织化学及实时荧光定量PCR方法检测TGF-β1、p-p38MAPK、NF-κB、MCP-1的表达。所有实验数据采用均数±标准差((?)±S)表示,满足正态方差齐的数据应用单因素方差分析进行统计学处理,不满足正态或方差齐时采用非参数检验进行数据处理,P<0.05有统计学意义。结果:1一般情况NC组大鼠饮食及尿量无明显变化,毛发光泽,反应灵敏,体重明显增长。与同期NC组相比,DM+HRS组和DM组逐渐出现多饮、多食、多尿、毛色晦暗,体重显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);与同期DM组相比,DM+HRS组体重变化不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。2生化指标2.1血糖与同期NC组对比,DM组和DM+HRS组大鼠血糖水平于8周末和12周末均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与同期DM组对比,DM+HRS组血糖明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。2.2尿素氮、血肌酐与同期NC组对比,DM组和DM+HRS组大鼠尿素氮、血肌酐值于8周末和12周末均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与同期DM组对比,DM+HRS组尿素氮、血肌酐值下降,差异有统计学意义(P<0.05)。2.3 24小时尿蛋白定量与同期NC组对比,DM组和DM+HRS组大鼠24小时尿蛋白定量于8周末和12周末均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与同期DM组对比,DM+HRS组大鼠24小时尿蛋白定量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3肾脏组织变化光镜下观察肾脏HE染色及PAS染色,NC组大鼠肾脏组织结构清晰,未见明显病理改变。与NC组对比,DM组和DM+HRS组肾小球体积增大,肾小球系膜细胞及系膜基质增多,基底膜增厚,12周末时较8周末病理改变更明显;与同期DM组对比,DM+HRS组肾脏组织结构较DM组得到改善。4免疫组织化学检测与同期NC组对比,DM组和DM+HRS组大鼠TGF-β1、p-p38MAPK、NF-κB、MCP-1表达于8周末和12周末均显著增多,差异有统计学意义(P<0.05);与同期DM组对比,DM+HRS组TGF-β1、p-p38MAPK、NF-κB、MCP-1表达水平不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05)。5实时荧光定量PCR检测与同期NC组对比,DM组和DM+HRS组大鼠TGF-β1 m RNA和MCP-1m RNA表达于8周末和12周末均增多,差异有统计学意义(P<0.05);与同期DM组对比,DM+HRS组TGF-β1 m RNA和MCP-1 m RNA表达水平不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1糖尿病大鼠肾脏组织TGF-β1、p-p38MAPK、NF-κB、MCP-1表达升高,表明存在明显的炎症反应。2富氢液可下调糖尿病大鼠肾脏组织TGF-β1、p-p38MAPK、NF-κB、MCP-1的表达,减轻炎症反应,延缓肾脏纤维化,起到肾脏保护作用,其机制可能与抑制TGF-β1/p38MAPK通路有关。