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目的:骨关节炎（osteoarthritis,OA）是常见的膝关节退行性疾病,是世界第二大致残性疾病,对社会造成沉重的经济负担。OA的发病与年龄、肥胖、性别、创伤等有关。近年来随着肥胖患病率的增加及人口老龄化,OA的患病人数也显著增加,已经成为了备受关注的公共卫生问题。但OA的发病机制还不明确,也无有效的治愈措施。自噬是参与衰老或故障细胞器在细胞内降解的复杂过程。自噬失调与某些癌症、神经退行性疾病、免疫功能障碍和衰老有关,是众多疾病潜在的治疗靶点,大量研究表明自噬在OA发展中起着至关重要的作用。micro RNA-33a（miR-33a）是位于甾醇调节元件结合蛋白基因中的一种内含子micro RNA,是某些自噬关键基因的靶标,提示miR-33a对自噬可能发挥重要的调节作用。PI3K/AKT/m TOR通路与OA的发展有密切关系,抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路可促进OA大鼠关节软骨细胞自噬并减轻炎症反应,AMPK/m TOR通路同样可以影响OA的发展,有研究发现通过调节AMPK/m TOR信号通路有效缓解软骨退化和衰老。本研究通过动物及临床样本研究并结合体外实验,探讨miR-33a调控PI3K/AKT/m TOR及AMPK/m TOR信号通路介导自噬,进而影响OA发生发展的机制,为揭示OA的发病机制及寻找新的治疗靶点提供理论依据。方法:1、在动物实验部分,随机取雄性C57BL/6小鼠分成对照组（sham组）和内侧半月板失稳手术（DMM）组,在鼠龄18周对sham组小鼠进行假手术仅切开关节囊后缝合,DMM组小鼠进行内侧半月板失稳手术后缝合切口。所有小鼠均于术后8周处死小鼠后取小鼠股骨内外侧髁软骨进行进一步实验研究,采用qRT-PCR法检测小鼠关节软骨中miR-33a的表达水平;采用HE、番红及番红O-固绿染色观察小鼠软骨组织损伤情况;采用免疫荧光染色及Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin1、p62、LC3的相对表达水平;采用免疫荧光染色及Western Blot法检测PI3K/AKT/m TOR及AMPK/m TOR信号通路相关蛋白的表达水平改变。2、临床样本检测,收集OA及非OA患者膝关节软骨样本,采用qRT-PCR法检测人关节软骨中miR-33a的表达水平;采用番红O-固绿染色观察人软骨组织损伤情况;采用免疫荧光染色及Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin1、p62、LC3的相关表达水平;采用免疫荧光染色及Western Blot法检测PI3K/AKT/m TOR及AMPK/m TOR信号通路的相关蛋白表达水平的改变。3、体外实验研究,采用SW1353细胞系,以浓度为10、20、40n M的IL-1β处理细胞,于24h、48h、72h收集细胞样本;采用qRT-PCR法检测SW1353细胞miR-33a的表达水平;用Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3的表达水平;确定最佳处理时间和处理浓度后,使用miR-33a的模拟物和抑制剂对20n M IL-1β处理的SW1353细胞进行转染,于48h和72h收集细胞样本,检测自噬相关蛋白表达水平的改变和PI3K/AKT/m TOR及AMPK/m TOR信号通路的相关蛋白表达水平的改变;使用m TOR激活剂MHY1485抑制自噬,再用miR-33a的模拟物进行回复实验,于48h收集细胞样本;采用Western Blot法检测miR-33a高表达和低表达后自噬相关蛋白Beclin1、p62、LC3的表达水平;采用Western Blot法检测PI3K/AKT/m TOR及AMPK/m TOR信号通路的改变情况。结果:1、在动物实验结果:sham组小鼠膝关节软骨组织完好,厚度均匀,软骨组织与骨组织之间分界清晰。DMM组小鼠膝关节软骨组织表明破损严重,厚度不一,软骨与骨分界不清。与sham组相比,DMM组小鼠膝关节软骨中的miR-33a表达水平显著提高（p＜0.05）;自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达水平显著提高（p＜0.01）,p62蛋白表达水平显著下降（p＜0.01）;p-PI3K、p-AKT、p-AMPK表达水平显著提高（p＜0.01）,p-m TOR表达水平显著下降（p＜0.01）。2、临床样本实验结果:CON组的关节软骨表层细胞排列整齐,软骨组织表面光滑平整,软骨外基质染色均匀。但OA组软骨组织染色后表层细胞排列混乱,软骨组织表面粗糙不平,软骨外基质染色不均匀。与CON组相比,OA患者膝关节软骨中的miR-33a表达水平显著提高（p＜0.05）;自噬相关蛋白Beclin和LC3表达水平显著提高（p＜0.01）,p62蛋白表达水平显著下降（p＜0.05）;p-PI3K、p-AKT、p-AMPK表达水平显著提高（p＜0.05）,p-m TOR表达水平显著下降（p＜0.05）。3、体外实验结果:3.1使用不同浓度IL-1β（10,20,40 n M）处理SW1353细胞24h,48h,72h后,发现与CON组相比,IL-1β组细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3在48h表达显著增加（p＜0.05）;72h表达显著下降（p＜0.05）。p62蛋白表达呈完全相反趋势,与CON组相比,IL-1β组细胞p62蛋白48h表达显著下降（p＜0.05）;72h表达显著上升（p＜0.05）。3.2与CON组相比,使用IL-1β处理后的SW1353细胞miR-33a的表达水平在48h显著提高（p＜0.05）;72h显著下降（p＜0.05）。3.3 miR-33a mimic和inhibitor对IL-1β处理48h SW1353细胞的影响,发现IL-1β+mimic组miR-33a的表达水平与IL-1β组相比显著提高（p＜0.05）;自噬相关蛋白LC3的表达水平显著提高（p＜0.05）,p62显著降低（p＜0.05）。IL-1β+inhibitor组miR-33a的表达水平与IL-1β组相比显著下降（p＜0.01）;自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达显著下降（p＜0.05）。3.4IL-1β处理细胞48h后,在IL-1β组p-PI3K、p-AKT、p-AMPK的蛋白表达水平显著提高（p＜0.05）,p-m TOR表达显著下降（p＜0.05）。使用IL-1β处理细胞48h后,利用miR-33a inhibitor造成miR-33a的低表达,可以引起PI3K/AKT/m TOR通路和AMPK/m TOR通路发生相应的表达水平的变化。但利用miR-33a mimic过表达miR-33a未引起通路发生对应水平的变化。3.5 IL-1β处理细胞72h后,与CON组相比,IL-1β组的p-PI3K、p-AKT、p-AMPK表达水平显著降低（p＜0.05）,p-m TOR的表达水平显著增高（p＜0.05）;使用IL-1β处理细胞72h后,利用miR-33a mimic造成miR-33a的过表达,可以引起PI3K/AKT/m TOR通路和AMPK/m TOR通路的变化。但利用miR-33a inhibitor低表达miR-33a未引起通路发生对应水平的变化。3.6使用m TOR激活剂MHY1485后,m TOR及p62蛋白的表达量显著增加（p＜0.05）,Beclin1及LC3蛋白的表达显著下降（p＜0.05）,加入miR-33a的mimic后,m TOR及p62的表达量下降,Beclin1及LC3蛋白的表达量上升（p＜0.05）。结论:1、在OA发病进程中,软骨细胞miR-33a的表达可能呈现先升高,后降低的趋势;2、软骨细胞miR-33a的表达与自噬呈正相关;3、miR-33a通过调控PI3K/AKT/m TOR及AMPK/m TOR信号通路调节软骨细胞自噬,进而影响OA的进展。