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禽类是重要的经济动物,而禽疫病一直制约着养禽业的发展。尽管目前有很多禽类疫苗可以供为选择,但它们大多是针对特异性免疫,起效慢,作用专一,禽类有时在疫苗提供有效保护前就已经发生了病毒感染。非特异性免疫是抵抗微生物感染的第一道防线,具有起效快,作用范围广的特点。因此,目前很多研究者都在寻找和鉴定能有效激活禽类非特异性免疫的新型免疫调节剂。本论文通过Real-time PCR、siRNA干扰、Western blot以及药物阻断信号通路等方法分析了柞蚕杆状病毒在提高鸡非特异性免疫上所起的重要作用,阐明了柞蚕杆状病毒侵入靶细胞的机制,并重点研究了柞蚕杆状病毒增强鸡非特异性免疫功能发生的细胞信号转导途径,具体研究内容及结果如下:1.体外以柞蚕出芽型杆状病毒粒子(BV)刺激鸡各免疫细胞,分别采用Real-timePCR检测鸡外周血单个核细胞(PBMC)和鸡巨噬细胞系(HD11)的各细胞因子的表达,Griess试剂法检测HD11细胞一氧化氮(NO)的产生量,β-葡萄糖苷酸酶释放法检测异嗜白细胞脱粒效应。体内以BV滴鼻免疫的雏鸡,24 h后再以致死剂量的鸡支气管炎病毒(IBV)进行攻毒,跟踪14d,记录雏鸡成活率。结果显示:BV能显著提高PBMC和HD11细胞的IL-6、IL-12、IFN-γ等细胞因子的mRNA表达水平,诱导HD11细胞产生大量NO,并刺激异嗜白细胞发生脱颗粒反应。25μg剂量的BV可以明显提高雏鸡的成活率达80%。以上结果表明BV在体内和体外都能有效激活鸡的非特异性免疫。2.采用Real-time PCR检测了经不同方式灭活的BV、脂质体包埋的BV DNA以及裸BV DNA诱导HD11细胞表达细胞因子的能力,并分析了细胞内吞和内体成熟抑制剂对BV诱导HD11细胞表达细胞因子的影响。结果显示:经不同方式灭活的BV其诱导HD11细胞活化的能力丧失;经脂质体包埋的BV DNA能够诱导HD11细胞活化,而裸BV DNA不能诱导HD11细胞活化;细胞内吞抑制剂MDC和内体成熟抑制剂氯喹均能抑制BV诱导的HD11活化。以上结果表明BV凭借囊膜上的蛋白识别靶细胞,依赖于靶细胞的内体成熟以内吞的方式进入细胞内,进入细胞后由病毒DNA起免疫激活作用。3.采用RT-PCR和Real-time PCR对BV作用前后的鸡HD11细胞Toll样受体(ChTLR1-5,7,21)的表达量进行了检测。结果显示,BV作用前,所有检测的ChTLR都有表达;BV作用后,只有ChTLR21的mRNA表达显著提高,其它ChTLR mRNA表达量不变或下降。进一步采用siRNA干扰技术将ChTLR21基因沉默,检测其对BV诱导的HD11细胞活化的影响。结果显示:ChTLR21 siRNA干扰后的HD11细胞其细胞因子(IFN-γ,和IL-12)的表达及NO的产生都明显下降。以上结果表明BV诱导HD11细胞的活化要依赖于ChTLR21途径。4.利用Western blot方法检测了BV作用后HD11细胞的MAPK和NF-κB蛋白的活化情况,并进一步利用各通路的特异性抑制剂分析了BV诱导HD11细胞表达细胞因子(IFN-γ和IL-12)及产生NO的信号转导途径。结果显示BV能够使MAPK信号通路中的ERK、P38和JNK蛋白发生磷酸化,并能激活NF-κB使其进入核内。P38和NF-κB的特异性抑制剂能够抑制BV诱导的HD11细胞的细胞因子(IL-12和IFN-γ)的表达及NO的产生;JNK的特异性抑制剂仅抑制细胞因子的表达;ERK的抑制剂则对细胞因子表达及NO的产生无抑制影响。以上结果表明,BV诱导HD11细胞细胞因子的表达要依赖于p38、JNK和NF-κB途径,而诱导NO的产生要依赖于p38和NF-κB途径。