丁酸梭菌的筛选及对斑马鱼幼鱼益生效果的评估

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随着水产行业迅速发展,工厂化大规模养殖成为趋势,疾病爆发、传统水产饲料资源日渐匮乏等成为发展限制因素。在畜牧业和水产养殖中,通过添加益生菌可以预防和治疗疾病,增加对饲料的消化性,提升生长性能,调节肠道菌群,刺激免疫,从而提升动物的健康性能和经济价值。丁酸梭菌作为厌氧益生菌,在人和畜牧中有多年的应用和研究,但在水产养殖中相对较少。本研究从土壤和鸡粪便中筛选具有产消化酶、黏附性、抑制致病菌等特性的丁酸梭菌,评价其体外生物学活性和安全性,结合模式动物斑马鱼,通过幼鱼体内实验,探究丁酸梭菌对斑马鱼幼鱼生长性能、抑制嗜水气单胞菌、抗氧化、产淀粉酶和免疫刺激方面的作用。(1)丁酸梭菌的筛选:采用厌氧培养法,通过选择性培养基富集和丁酸梭菌特异性引物PCR方法高效筛选,16S rDNA基因鉴定得到15株丁酸梭菌菌株。根据样品来源选取5株进行疏水性、自凝集、抑制嗜水气单胞菌、产淀粉酶和菌生长量的测定。结果显示:与其它菌株相对比,丁酸梭菌11号疏水性为24.12%,自凝集性(5h)为68.30%,有较好黏附性,抑菌圈达到14.3mm,形成的淀粉酶透明圈/菌落直径为2.45,RCM液体培养24h菌量达到2.22×10~7cfu/ml,综合性能较好。(2)丁酸梭菌生物学特性:评估丁酸梭菌11号对胃肠液环境,高温和氧气的耐受性,是否含有相关致病基因。通过实验结果显示,在含有0.3%猪胆盐的RCM液体培养基中依旧可以较好的生长,相对于对照,存活率为62.47%,丁酸梭菌11号在分别经过160min的人工模拟胃液和肠液处理后,与对照相比,存活率均在80%以上,表明丁酸梭菌11号能够很好的耐受胃肠道环境。在经过温度70℃,20min时长的水浴加热处理后,与对照相比,有61.23%的存活率。对高温具有较好的耐受性。经过10和30min的有氧暴露后,存活率都在55%以上,表明11号菌对短期暴露氧气环境的非致死性,在遇到生长条件合适时可以重新萌发。通过PCR方法检测发现丁酸梭菌11号不含致病基因-肉毒梭菌E。丁酸梭菌11号具有良好的生物学耐受性,适应加工储藏和胃肠道环境,不含梭菌属常见致病基因-肉毒梭菌E,具有良好的益生潜能。(3)在丁酸梭菌11号体外研究的基础上,结合斑马鱼模式动物,探究其对斑马鱼生长性能、抗病、抗氧化、产淀粉酶和对免疫细胞因子调控的影响。在斑马鱼出生后5-15d期间,通过养殖水添加丁酸梭菌,在15-40d期间,通过喂食含菌饲料添加丁酸梭菌。结果显示CB2组(水中添加浓度10~5cfu/ml,饲料中添加浓度10~7cfu/g)在喂养40d后,相对于对照组,斑马鱼体重增加(P<0.01),对40d的斑马鱼幼鱼进行嗜水气单胞菌攻毒实验,实验组与对照组死亡率没有显著性差异,CB2组有一定延缓斑马鱼幼鱼死亡时间的效果。加菌的三个实验组T-AOC、α-淀粉酶水平均显著升高,MDA水平显著下降,与对照组相比都具有显著性差异(P<0.05)。CB2组提高细胞因子TLR2、IL-8和TNF-α的mRNA相对表达水平,对MyD88、IGF-1a和IL-10 mRNA的相对表达水平没有影响,推测丁酸梭菌可能以MyD88非依赖性的方式,通过TLR2信号传导刺激免疫细胞分泌IL-8和TNF-α。综上所述,本研究筛选到的丁酸梭菌11号,在产淀粉酶、耐胃肠液、耐高温等方面具有良好的性质,在斑马鱼幼鱼体内实验中,丁酸梭菌可以在水中和饲料中存活,不影响斑马鱼幼鱼存活率,可以提高幼鱼生长性能,对嗜水气单胞菌攻毒有延缓死亡的趋势,可以提高鱼体抗氧化、产淀粉酶水平、降低MDA含量、提高TLR2、IL-8和TNF-αmRNA相对表达水平,刺激免疫系统,作为益生菌在水产和畜牧中有良好的应用价值。
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